? ? ? ? 本期式曲，我們一起來(lái)分析一下2018年發(fā)表在Cancer Research（2019年該雜志最新影響因子為8.378）上的一篇由瑞典皇家理工學(xué)院發(fā)表的關(guān)于皮膚惡性黑色素瘤的文章。
文章題目：Spatially Resolved Transcriptomics Enables Dissection of Genetic Heterogeneity in Stage III Cutaneous Malignant Melanoma
空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)有助于分析Ⅲ期皮膚惡性黑色素瘤的遺傳異質(zhì)性
? ? ? ? 首先我們簡(jiǎn)單說(shuō)一下背景孵滞，皮膚惡性黑色素瘤存在廣泛的瘤內(nèi)和瘤間異質(zhì)性，是所有癌癥中突變負(fù)荷最高的癌癥之一顷蟆。同時(shí)也是一種高免疫原性的癌癥修壕，能夠誘導(dǎo)原位癌和轉(zhuǎn)移癌中的與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的免疫反應(yīng)。
? ? ? ? 材料選擇為III期皮膚惡性黑色素瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的活檢樣本损同。并且記錄了不同存活時(shí)間翩腐，共四個(gè)病人樣本，其中一個(gè)是長(zhǎng)存活期的病人樣本（>60個(gè)月）膏燃，每個(gè)樣本兩份組織切片樣本茂卦。這些病人組織樣本切片都通過(guò)了H&E染色和有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家對(duì)組織區(qū)域進(jìn)行劃定，圈出腫瘤區(qū)域组哩、基質(zhì)和淋巴組織區(qū)域等龙。然后利用空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序芯片進(jìn)行后續(xù)處理处渣，由于前幾期我們已經(jīng)介紹過(guò)了原理，這里不再贅述蛛砰。我們主要看下他做了哪些工作和思路是什么罐栈。
? ? ? ? 最終一共分析了2200多個(gè)spot的數(shù)據(jù)，并且每個(gè)樣本的數(shù)據(jù)都測(cè)到近飽和的程度泥畅，平均每個(gè)spot 300個(gè)轉(zhuǎn)錄本悠瞬。首先它將八個(gè)樣本的每個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行人為的混合，形成bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)涯捻，然后對(duì)這八個(gè)樣本進(jìn)行PCA分析浅妆，可以看到同一個(gè)病人腫瘤組織間的變異程度不大，每個(gè)病人的樣本聚到一起障癌，并和其他病人樣本明顯分開(kāi)凌外。利用分層聚類(lèi)的方法對(duì)50個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，進(jìn)一步證明了這個(gè)結(jié)果涛浙。
? ? ? ? 進(jìn)一步對(duì)這2200多個(gè)spot數(shù)據(jù)進(jìn)行特定基因的分析和t-sne的分析康辑，可以看到，腫瘤組織間具有非常大的基因表達(dá)的變異轿亮。這里結(jié)合起來(lái)看圖A和圖B疮薇，圖中兩種不同形狀的切片來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同的病人。上面活檢樣本1我注，病理學(xué)家圈出來(lái)的黑色素瘤區(qū)域和B中上面基因表達(dá)數(shù)據(jù)是能夠明顯對(duì)應(yīng)上的按咒，并且B中基因表達(dá)區(qū)域的邊界非常清晰。我們?cè)倏磮D中下面的活檢樣本2但骨，盡管病理學(xué)家圈出來(lái)的邊界是比較清晰的励七，但是我們看B中下面對(duì)應(yīng)基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，卻呈現(xiàn)出明顯變化程度很高的表達(dá)模式奔缠，說(shuō)明腫瘤異質(zhì)性很高吠式。從病人存活期看度气，活檢樣本1的病人是存活周期長(zhǎng)的病人葛峻，而活檢樣本2則是存活期的病人滔蝉。我們?cè)賮?lái)看腫瘤因子的活性情況，C圖中Melanoma-A和-B分別用來(lái)標(biāo)識(shí)不同的激活因子表達(dá)情況闷哆，其中-A標(biāo)識(shí)CD63和 PMEL腰奋，-B標(biāo)識(shí)S100B和FTH1。最右邊是淋巴組織區(qū)域阳准。-A與病理學(xué)家注釋的區(qū)域是對(duì)應(yīng)的氛堕，-B和-A在這兩個(gè)因子表達(dá)上則是有重疊的馏臭。淋巴組織是對(duì)應(yīng)的野蝇。D是-A和-B中分別表達(dá)前五位的基因讼稚，可以看到是存在明顯差別的。E圖是淋巴組織和腫瘤組織切片放大圖的比較绕沈，同樣能看出兩個(gè)樣本的顯著差別锐想。
? ? ? ? 接下來(lái)該文章對(duì)腫瘤微環(huán)境的基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析≌Ш活檢組織1中的淋巴組織在空間上距離腫瘤組織較近赠摇，但是還保持的明顯的距離，比較適合分析腫瘤微環(huán)境的互作浅蚪，因此被選為后續(xù)分析樣本藕帜。首先鑒定了一些高表達(dá)的基因?FTL, B2M, APOE, 和 HLA相關(guān)基因 (HLA A-C)。然后對(duì)該樣本的280多個(gè)spot數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析惜傲，聚類(lèi)得到4個(gè)clusters洽故，這4個(gè)clusters與病理學(xué)家注釋的區(qū)域完全對(duì)應(yīng)，看圖A和圖B盗誊。這些基因表達(dá)的情況會(huì)受到淋巴組織與腫瘤細(xì)胞距離的影響时甚。然后看E圖是標(biāo)注了對(duì)分群有顯著作用的基因，其中PMEL主要在腫瘤組織中表達(dá)哈踱。SPP1表達(dá)覆蓋的區(qū)域更大荒适，不只是腫瘤組織，還包括與腫瘤組織比較近的淋巴組織开镣。CD74主要在遠(yuǎn)離腫瘤組織的淋巴組織區(qū)域表達(dá)刀诬。而IGLL5則是在距腫瘤組織更近的淋巴區(qū)域表達(dá)。
? ? ? ? 這篇文章的內(nèi)容就是這些邪财，其實(shí)總體來(lái)看內(nèi)容非常簡(jiǎn)單舅列，就是分析腫瘤異質(zhì)性情況，拿一些marker基因進(jìn)行說(shuō)明卧蜓，并不是去講一個(gè)完整的story出來(lái)帐要。
? ? ? ? 按照這個(gè)文章的思路，我們可以總結(jié)幾點(diǎn)利用空間轉(zhuǎn)錄組做腫瘤異質(zhì)性需要考慮的地方：
1. 選擇感興趣的癌癥樣本的活檢樣本弥奸，可以考慮要做同一個(gè)病人的原位癌和轉(zhuǎn)移癌的異質(zhì)性榨惠，也可以考慮做不同病人間的原位癌或者轉(zhuǎn)移癌的異質(zhì)性，當(dāng)然盛霎，同時(shí)做也是可以的赠橙。每個(gè)樣本可以考慮做2個(gè)重復(fù)，避免出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)層面的影響愤炸，目前10x Genomics的芯片是4個(gè)捕獲區(qū)域期揪，做兩種樣本是完全合適的。
2. 組織切片需要有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家進(jìn)行注釋?zhuān)@一點(diǎn)很關(guān)鍵规个，一般的病理室大夫可能只能注釋出來(lái)腫瘤區(qū)域凤薛，但是其他區(qū)域并不一定能夠清晰注釋出來(lái)姓建，這會(huì)對(duì)后續(xù)對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)分析造成麻煩。
3. 數(shù)據(jù)量缤苫，我們不能說(shuō)多少就能滿(mǎn)足分析速兔，目前10x Genomics建議的是0.05M/spot，但是這只是個(gè)推薦的數(shù)據(jù)量活玲，不能說(shuō)對(duì)所有的樣本都適用涣狗，本文是測(cè)到接近飽和了，不過(guò)才3000個(gè)基因每個(gè)spot著實(shí)不多舒憾，可能也跟捕獲區(qū)域本身的探針數(shù)量有關(guān)系镀钓，現(xiàn)在10x的增加了，基因數(shù)應(yīng)該還會(huì)再提高镀迂，有經(jīng)濟(jì)能力的建議盡可能測(cè)飽和掸宛，避免漏掉豐度較低的基因轉(zhuǎn)錄本≌凶荆可以先按0.05M/spot去做唧瘾，分析下飽和度，不行再對(duì)文庫(kù)進(jìn)行加測(cè)别凤，能達(dá)到80%以上應(yīng)該是能夠滿(mǎn)足分析要求了饰序。
4. 提前查文獻(xiàn)，找一些marker基因规哪，一方面看異質(zhì)性求豫，另一方面與病理學(xué)家注釋區(qū)域去比較一下，證明我們的方法是沒(méi)有問(wèn)題的诉稍，然后還可以通過(guò)不同區(qū)域差異表達(dá)基因的比較去尋找新的marker基因蝠嘉，甚至是治療靶點(diǎn)。
5. 空間轉(zhuǎn)錄組做腫瘤還有一個(gè)重大意義杯巨，就是早診蚤告，基因表達(dá)數(shù)據(jù)結(jié)合病理學(xué)家注釋的結(jié)果一起去看，能夠避免很早起的癌癥服爷，難以通過(guò)病理注釋出來(lái)的問(wèn)題杜恰，一些不明顯的早期發(fā)生的腫瘤區(qū)域，在marker基因表達(dá)數(shù)據(jù)上會(huì)比較顯著仍源，可以協(xié)助醫(yī)生判斷癌癥發(fā)展階段心褐，及時(shí)采取對(duì)應(yīng)的治療措施（這或許才是該技術(shù)長(zhǎng)期發(fā)展最大的價(jià)值）。
6. 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)還是起步階段笼踩，從文章發(fā)表的角度來(lái)講逗爹，本文這樣一個(gè)工作能發(fā)表在cancer research上著實(shí)很劃算。目前可以說(shuō)嚎于，還是在利用新穎的技術(shù)作為亮點(diǎn)發(fā)表文章掘而，所以對(duì)文章的故事性要求較低挟冠，換不同的癌種，采用類(lèi)似的思路來(lái)做是極有可能發(fā)表不錯(cuò)的文章的镣屹，有興趣的可要抓緊了圃郊，過(guò)了新技術(shù)應(yīng)用的一兩年的發(fā)展熱潮价涝，再發(fā)表高水平文章就比較困難了女蜈。
「2019年11月09日 ·北京」
