1、樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解诸狭。

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋君纫。手動劇烈振蕩管體15秒后作谚，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘庵芭。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相妹懒，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中双吆。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%眨唬。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA好乐，混勻后15到30℃孵育10分鐘后匾竿，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊蔚万。

④RNA清洗 移去上清液岭妖，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀反璃￡腔牛混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘淮蜈。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液斋攀，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時梧田，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次淳蔼，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用裁眯。

2鹉梨、RNA質(zhì)量檢測

1）紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后穿稳，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值存皂，測定RNA溶液 濃度和純度。

① 濃度測定

A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml司草。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml艰垂。具體計算如下：

RNA溶于40 μl DEPC水中泡仗，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中猜憎，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5ul用來測量以后娩怎，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度胰柑，比值范圍1.8到2.1截亦。

2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃柬讨，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)崩瓤。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 ? ? ? 成分

0.4M???? MOPS，pH 7.0

0.1M???? 乙酸鈉

0.01M?? EDTA

灌制凝膠板踩官，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液却桶。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)蔗牡，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米颖系。

②準(zhǔn)備RNA樣品

取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液辩越，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml嘁扼。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預(yù)電泳5min黔攒，隨后將樣品加入上樣孔趁啸。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm督惰。

④紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型）不傅，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶姑丑，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成蛤签。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成栅哀。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)称龙，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶留拾，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散疏尿。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果贡羔。

3杀狡、樣品cDNA合成

①反應(yīng)體系

序號???? 反應(yīng)物??????? ? ? ? ? ?? 劑量

1???????? 逆轉(zhuǎn)錄buffer ? ???????? 2μl

2??????? 上游引物 ? ? ? ? ???????? 0.2μl

3??????? 下游引物 ? ? ? ? ? ? ? ?? 0.2μl

4??????? dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.1μl

5??? ? ? 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV?????? 0.5μl

6????? ? DEPC水 ? ? ? ? ? ? ? ? ??? 5μl

7??? ? ? RNA模版 ? ? ? ? ? ? ? ? ?? 2μl

8 ? ? ?? 總體積??????????????????? ? 10μl

輕彈管底將溶液混合坯沪，6000rpm短暫離心构订。

②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致端三，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl锯茄，37℃水浴60分鐘。

③取出后立即95℃干浴3分鐘谈火，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液侈询，保存于-80℃待用。

4糯耍、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR

①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011扔字，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109温技、108革为、107、106舵鳞、105震檩、104，以備用蜓堕。

②反應(yīng)體系如下：

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

序號?????????? 反應(yīng)物??????????? ?? 劑量

1?????? SYBR Green 1 染料???? 10μl

2????? 陽性模板上游引物F ??? 0.5μl

3 ? ?? 陽性模板下游引物R ?? 0.5μl

4????? dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.5μl

5 ? ? Taq酶?????????????????????????? 1μl

6??? ? 陽性模板DNA ? ? ? ? ? ?? 5μl

7?? ?? ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? 32.5μl

8?? ?? 總體積?????????????????????????? 50μl

輕彈管底將溶液混合恳蹲，6000rpm短暫離心。

管家基因反應(yīng)體系：

序號???????????? 反應(yīng)物?????????? ? ???? 劑量

1?????????? SYBR Green 1 染料 ? ?? 10μl

2?????????? 內(nèi)參照上游引物F????? ?? 0.5μl

3?????????? 內(nèi)參照下游引物R??????? 0.5μl

4?????????? dNTP???????????????????????? ? 0.5μl

5?????? ? ? Taq酶?????????????????????????? 1μl

6????? ? ?? 待測樣品cDNA???????????? 5μl

7?????? ? ? ddH2O???????????????????????? 32.5μl

8?????? ? ? 總體積??????????????? ? ? ? ? ? 50μl

輕彈管底將溶液混合俩滥，6000rpm短暫離心嘉蕾。

③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘霜旧，然后93℃ 1分鐘错忱，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)挂据。

5以清、 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板

①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)崎逃。

反應(yīng)體系：

序號 ? ? ? ? ? ? 反應(yīng)物????????????????? 劑量

1???????????? 10× PCR緩沖液 ? ? ?? 2.5 ul

2????????????? MgCl2 溶液???????????? 1.5 ul

3???????????? 上游引物F ? ? ? ? ? ? ?? 0.5 ul

4???????????? 下游引物R ? ? ? ? ? ? ?? 0.5 ul

5???????????? dNTP混合液 ? ? ? ? ??? 3 ul

6???????????? Taq聚合酶??????????????? 1 ul

7???????????? cDNA?????????????????????? 1 ul

8 ? ? ? ? ? ? 加水至總體積為??????? 25ul

輕彈管底將溶液混合掷倔，6000rpm短暫離心。

35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘个绍；55℃1分鐘勒葱；72℃1分鐘）； 72oC延伸5分鐘巴柿。

②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳凛虽，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶广恢。

③將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010凯旋，依次稀釋至109、108、107至非、106钠署、105、104幾個濃度梯度荒椭。

6 谐鼎、待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR

①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應(yīng)體系。

體系配置如下：

序號????????? 反應(yīng)物??????????????? 劑量

1?????? SYBR Green 1 染料 ? ? 10 ul

2?????? 上游引物??????????????? ? ?? 1ul

3?????? 下游引物???????????????????? 1ul

4??????? dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1ul

5?????? Taq聚合酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2ul

6??????? 待測樣品cDNA??????????? 5ul

7 ? ? ? ddH2O ?????????????????????? 30ul

8?????? 總體積??????????????????????? 50 ul

輕彈管底將溶液混合戳杀，6000rpm短暫離心该面。

②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性信卡，然后按93℃ 1分鐘隔缀，55℃1分鐘，72℃1分鐘傍菇，共40做個循環(huán)猾瘸，最后72℃7分鐘延伸。

7 丢习、實時定量PCR使用引物列表

引物設(shè)計軟件：Primer Premier 5.0牵触，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)咐低；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)揽思。

8 電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳见擦，GoldView?染色钉汗，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。