實(shí)驗(yàn)步驟：??
1設(shè)計(jì)sgRNA
按照“20N+NGG(PAM)”的設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)sgRNA荧关，至少設(shè)計(jì)3條咏尝。
2構(gòu)建sgRNA和dCas9-target 質(zhì)粒
3压语、構(gòu)建dCas9-target穩(wěn)轉(zhuǎn)株
穩(wěn)轉(zhuǎn)株蛋白構(gòu)建完成后啸罢，用flag抗體或目的蛋白抗體檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株是否構(gòu)建成功，如果載體上有熒光蛋白胎食，可用熒光檢測(cè)細(xì)胞株是否構(gòu)建成功扰才。
4、Flag-ChIP-QPCR驗(yàn)證sgRNA的工作效率
實(shí)驗(yàn)問(wèn)題與解決方案
1怎樣避免sgRNA脫靶?
脫靶效應(yīng)與sgRNA的精確設(shè)計(jì)有著密切的關(guān)系厕怜，一般的sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站都會(huì)給出設(shè)計(jì)序列相應(yīng)的脫靶位點(diǎn)衩匣、GC含量或綜合得分。
我們一定要選擇綜合得分高和脫靶位點(diǎn)少的sgRNA序列粥航，且一般至少設(shè)計(jì)3條sgRNA琅捏。
2怎樣選擇CRISPR系統(tǒng)？
如果要靶標(biāo)多個(gè)基因位點(diǎn)躁锡，建議您選擇CRISPR-cpf1系統(tǒng)午绳，這個(gè)系統(tǒng)的sgRNA只有40多bp，比普通Cas9蛋白的sgRNA要小一半以上映之，一個(gè)sgRNA載體可同時(shí)插入多個(gè)sgRNA拦焚。
如果要更精確的編譯基因組，建議選擇Cas9 nicknase杠输，這個(gè)蛋白是Cas9的突變體赎败，只切割DNA的一條鏈，因此蠢甲，這個(gè)系統(tǒng)需要設(shè)計(jì)兩個(gè)sgRNA僵刮，同時(shí)切割，才能產(chǎn)生DNA雙鏈缺口鹦牛。同時(shí)搞糕，這種方法大大降低了脫靶效應(yīng)。
3 Cas9的單切系統(tǒng)和雙切系統(tǒng)是什么曼追？
Cas9的雙切系統(tǒng)是未突變的Cas9內(nèi)切酶窍仰，Cas9內(nèi)切酶可以切割雙鏈DNA。Cas9
的單切系統(tǒng)使用的是單突變Cas9內(nèi)切酶礼殊，即Cas9 Nicknase驹吮，Cas9 Nicknase需要兩套才可以切割雙鏈DNA。
4 怎樣選擇CRISPR系統(tǒng)的質(zhì)粒晶伦？
?如果您的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高碟狞，可使用普通載體，如果您的細(xì)胞不容易轉(zhuǎn)染婚陪，建議使用腺病毒或慢病毒載體族沃。
