今天給大家分享一篇优俘,高通量篩選的文章京办,該文章發(fā)表于2020年3月的Cell Reports上,文章的題目是《High-Throughput Screens of PAM-Flexible Cas9 Variants for Gene Knockout and Transcriptional Modulation》帆焕,講的是用高通量篩選技術惭婿,去篩選對基因敲除以及基因的轉錄調控相對有效的可識別靈活PAM的Cas9突變體。
按照慣例叶雹,先來了解下作者團隊财饥。作者們來自NEW YORK GENOME CENTER,通訊作者Neville E. Sanjana似乎在張鋒實驗室也待過折晦。
回到文章钥星,我們來看看文章的一個研究背景,作者在SUMMARY中也提到了满着,主要是依托于2個Cas9突變體的發(fā)現(xiàn)—識別NG PAM的xCas9和Cas9-NG谦炒。
這里多說一句贯莺,xCas9是David Liu團隊在2018年2月發(fā)現(xiàn)的,發(fā)了篇nature宁改,文章名字是《Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity》缕探;Cas9-NG是來自日本的團隊在2018年9月發(fā)現(xiàn)的,他們與張鋒團隊也有合作还蹲,文章發(fā)表于Science撕蔼,文章名字是《Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space》。感興趣的可以去了解學習下秽誊。
回到本文,作者想利用高通量篩選技術琳骡,比較下spCas9以及xCas9和Cas9-NG在基因敲除锅论,基因轉錄激活、抑制上楣号,誰的表現(xiàn)更好最易,同時,以期能夠在篩選過程中炫狱,設計開發(fā)出更優(yōu)的Cas9突變體藻懒。
我們來看下作者的設計思路以及邏輯(下圖1)。
首先视译,作者選擇了CD45嬉荆,CD46和CD55共3個基因作為靶向區(qū)域來分別設計sgRNA。作者對每個基因的TSS(轉錄起始位點)上下游各1.5kb(共3kb)以及CDS區(qū)設計不同PAM的sgRNA(見下圖2)酷含。文中用到的載體都是在lentiCRISPRv2(Plasmid #98290)上改造的鄙早。以CD45基因為例,在該基因的敲除上椅亚,用到了3種敲除載體(sgRNA相同限番,包含TSS區(qū)和CDS區(qū)的),分別使用了Cas9呀舔,Cas9-NG和xCas9弥虐,作者使用不同的Barcode來區(qū)分不同的載體。然后媚赖,將這3種載體分別轉染K562細胞系霜瘪,再通過puro分別去篩選陽性細胞,獲得了3種細胞類群省古,并通過細胞計數(shù)粥庄,將3種細胞類群的相同數(shù)量陽性細胞混到一起培養(yǎng)一定天數(shù)。最后豺妓,利用流式細胞儀將細胞分選開惜互,以此篩選出敲除效果好的Cas9酶布讹。作者將這種篩選方式稱為Competition Screen,意思是競爭性篩選训堆。
這里再啰嗦一句描验,作者選用的CD45等基因是膜蛋白類基因,可以通過相應抗體進行熒光標記(細胞免疫組化)坑鱼,然后進行FACS(流式細胞熒光分選)膘流,將熒光強和弱的細胞群體分選開,針對敲除來講的話鲁沥,如果熒光強呼股,就表明敲除效果差,而熒光弱画恰,就表明敲除效果好彭谁,這就是作者的篩選邏輯。
還是以CD45基因為例允扇,在基因的激活轉錄表達上缠局,作者參照Cas9在D10A/H840A處的突變獲得的失活的dCas9,同樣獲得了dCas9-NG和dxCas9突變體考润。并利用VPR元件狭园,構建了用于激活轉錄表達的3種載體(dCas9,dCas9-NG和dxCas9載體)糊治,之后篩選的方式就同上述敲除篩選的方式唱矛。如果熒光強的話,就表明激活轉錄表達的效果好俊戳,反之揖赴,效果差。
此外抑胎,在CD45基因的抑制轉錄上燥滑,原理同激活類似,只是構建了不同的載體阿逃,轉染獲得了不同的細胞系铭拧。這里不再贅述。
我們可以看到恃锉,只是針對CD45基因搀菩,作者就構建了9種載體(敲除,激活破托,抑制各3種)肪跋,轉染篩選出了9個細胞類群。3個基因的話土砂,就需要構建27種載體州既,27個細胞類群谜洽。工作量還是很大的。
我們再來看一下實驗結果:
RESULT 1:Cas9-NG Targets NGH PAMs with 2- to 4-Fold Lower Nuclease Activity Than Cas9 at NGG PAMs
通過競爭性篩選阐虚,作者發(fā)現(xiàn)WT Cas9在NGG位點的敲除效果最好,同時解釋了蚌卤,雖然Cas9-NG和xCas9擴寬了PAM的識別范圍实束,但是是以犧牲編輯效率為代價的。
同時逊彭,實驗結果也表明咸灿,xCas9在NGH(H=A,T,C)位點的編輯效率不如Cas9-NG。
RESULT 2:Cas9-NG, but Not xCas9 or WT Cas9, Efficiently Modulates Gene Expression at NGH PAMs
實驗結果表明侮叮,Cas9-NG(dCas9-NG)在NGH PAM位點的抑制和激活轉錄表達的效率上都是強于WT Cas9的析显。
同時,又再次表明了xCas9在NGH(H=A,T,C)位點的效用是最弱的签赃。
RESULT 3:Introduction of Cas9-NG Mutations in xCas9 Partially Rescues Nuclease Activity and Increases Transcriptional Activation at NGH PAMs
基于上述2個結果,作者就思考分尸,有沒有什么辦法能夠將xCas9在NGH(H=A,T,C)位點的效用給提升锦聊。所以杨帽,作者就將Cas9-NG的突變給引入xCas9中昔瞧,構造了一個新的核酸酶胡嘿,xCas9-NG(見下圖)水由。
然后太伊,我們來看看這個新核酸酶的使用效果鲤桥。
結果表明芽淡,xCas9-NG相比xCas9在敲除效率上,雖有提升豆赏,但效果不明顯挣菲,且敲除效果均低于Cas9-NG(虛線baseline)。
在激活轉錄表達上掷邦,xCas9-NG相比xCas9的激活效率有較為明顯的提升白胀,且遠優(yōu)于Cas9-NG(虛線baseline)。
在抑制效果上抚岗,因xCas9-NG抑制效果未有較明顯改變或杠,故作者沒在正文提,只是將抑制效果對比放在了附件中宣蔚。這里也不再贅述向抢。
最后认境,我們來看一下文章的Highlights來做一下總結。
1. 雖然有了很多靈活PAM的SpCas9突變體笋额,但卻是以犧牲編輯效率為代價的元暴;
2.?Cas9-NG在NG PAMs的效用均優(yōu)于xCas9;
3. 將Cas9-NG的突變引入xCas9突變體中兄猩,創(chuàng)造了一個新型核酸酶茉盏,xCas9-NG;
4.?xCas9-NG的激活轉錄表達的調控效果優(yōu)于Cas9-NG和xCas9枢冤。
至此鸠姨,文章分享就結束了,以上只是我個人對文章的理解淹真,如有不同意見讶迁,歡迎大家探討。同時核蘸,希望我的分享對大家理解文章能有所幫助巍糯。如果大家覺得有用的話,請幫忙點個贊客扎,謝謝大家祟峦。