這一篇是今年剛剛發(fā)表在Circulation Research上的文章，對(duì)Sham組和TAC 1w 4w小鼠心臟的免疫細(xì)胞做了質(zhì)譜流式CyTOF姻乓，又對(duì)Sham和TAC 1w小鼠心臟組織測(cè)了CITE-seq晰搀，發(fā)現(xiàn)組織原位巨噬細(xì)胞起了比較重要抑制纖維化和促進(jìn)血管生成的作用五辽，而MOMFs則具有強(qiáng)促纖維化作用。
此外厕隧，去年發(fā)表的一篇circulation 單細(xì)胞軌跡重建揭示病理性心肌肥厚干預(yù)原則對(duì)Sham和TAC 2 5 8 11w的小鼠心臟心肌和非心肌進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序奔脐，發(fā)現(xiàn)了巨噬在TAC 2-5w 心臟從EF正常到異常的過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用。
此前關(guān)于心肌肥厚和心衰的研究主要集中在心肌細(xì)胞特異性的通路上吁讨。
1. Pressure Overload–Induced Cardiac Remodeling Profoundly Alters the Cardiac Immune Cell Composition
對(duì)sham髓迎，1w和4wTAC小鼠心臟的測(cè)了CyTOF
Fig 1A：質(zhì)譜流式的結(jié)果顯示，和sham組相比建丧，1w TAC小鼠心臟CD45+免疫細(xì)胞的比例和絕對(duì)值都明顯增加排龄，而4w TAC小鼠心臟CD45+免疫細(xì)胞的比例和絕對(duì)值又出現(xiàn)了下降。
Fig 1B：使用ViSNE (Visualized stochastic neighbor embedding) 分析CyTOF的結(jié)果翎朱，做了細(xì)胞群注釋橄维。結(jié)果提示TAC之后CD64+F4/80+巨噬細(xì)胞出現(xiàn)了明顯增加。
Fig 1C：作者隨后分析了心臟免疫細(xì)胞的巨噬marker表達(dá)拴曲，發(fā)現(xiàn)CD11b+CD64+巨噬細(xì)胞表達(dá)不同水平的CX3CR1, CD206, MHC-II, CCR2和Lyve1争舞。
Fig 1D：隨后作者將CD11b+CD64+巨噬細(xì)胞圈出，并查看了TIMD4, CX3CR1和CCR2的表達(dá)澈灼。組織原位巨噬細(xì)胞和單核起源的巨噬細(xì)胞monocyte-derived macrophages (MoMF)在TAC后1w都出現(xiàn)了增加竞川。然而在TAC后4w時(shí)大部分都恢復(fù)到了sham水平店溢。
Fig 1E：為了驗(yàn)證Fig 1D的結(jié)果，作者換了一種圈門(mén)策略委乌。根據(jù)CCR2和MHC-II的表達(dá)來(lái)區(qū)分組織原位巨噬和MoMF床牧。同樣的，發(fā)現(xiàn)TAC 1w后所有巨噬細(xì)胞都出現(xiàn)增加遭贸，同時(shí)CCR2-巨噬增加最為顯著戈咳。
小結(jié)：這些結(jié)果提示巨噬細(xì)胞尤其是組織原位巨噬細(xì)胞在早期肥厚過(guò)程中可能起了重要作用。
2. Single-Cell RNA Sequencing Identifies 12 Different Monocyte/Macrophage Clusters
為了更近一步探究心臟巨噬細(xì)胞的作用壕吹，作者對(duì)4只sham小鼠和6只TAC 1w小鼠心臟的免疫細(xì)胞進(jìn)行了CITE-seq（這里用的是droplet-based scRNA-seq）著蛙。
Fig 2A：送樣流程。是先把每個(gè)樣本和帶有DNA標(biāo)簽的抗體孵育算利，然后混樣（測(cè)序前混樣册踩，抗體上的DNA標(biāo)簽應(yīng)該除了抗體的barcode以外還有樣品的barcode。）
Fig 2B：測(cè)到了60981個(gè)細(xì)胞效拭，做了質(zhì)控和barcode去卷積暂吉。
Fig 2C：得到33566個(gè)帶有單一barcode的細(xì)胞。其中5854個(gè)來(lái)自sham組缎患，27712來(lái)自TAC組慕的。
Fig 2D：對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行降維聚類，得到25個(gè)cluster挤渔。包括12個(gè)單核巨噬群肮街，5個(gè)T細(xì)胞群，3個(gè)B細(xì)胞群判导，1個(gè)DC群嫉父，1個(gè)PMN群和1個(gè)NK群。單核巨噬細(xì)胞明顯占比最高眼刃。
Fig 2E：25個(gè)群的marker基因熱圖
Fig 2F：25個(gè)群的在Sham和TAC組的比例變化绕辖。在數(shù)量最多的單核巨噬細(xì)胞中，有8個(gè)群發(fā)生了有意義的比例變化擂红，提示可能發(fā)揮了重要作用仪际。
3. Gene Expression Analysis Distinguishes Resident and Monocyte-Derived Macrophages
接下來(lái)，作者對(duì)12個(gè)巨噬細(xì)胞群做了更精細(xì)的注釋（主要是區(qū)分了組織原位巨噬細(xì)胞和MoMF）昵骤。
Fig 3A：首先根據(jù)Ccr2和Timd4來(lái)區(qū)分了TIMD4+CCR2-原位巨噬細(xì)胞和CCR2+招募來(lái)的巨噬树碱。組織原位巨噬特異性高表達(dá)Lyve1, Cd163和 Ccl24，招募來(lái)的巨噬高表達(dá)抗原呈遞基因（MHC-II genes: H2- Aa, H2-Ab1, H2-Eb1, H2-DMa, H2-DMb1, and Cd74）变秦，單核細(xì)胞高表達(dá)Ly6c2和Plac8成榜。
Supplemental Fig 3A：為了更好的比較組織原位巨噬和招募來(lái)的巨噬之間的基因表達(dá)差異，作者將組織原位巨噬細(xì)胞和MoMF單獨(dú)注釋蹦玫。組織原位巨噬細(xì)胞包含1赎婚，3雨饺，4，11群惑淳，MoMF包含0，5饺窿，10歧焦，14群。
Fig 3B：隨后作者比較了組織原位巨噬細(xì)胞和MoMF的轉(zhuǎn)錄差異肚医，發(fā)現(xiàn)組織原位巨噬細(xì)胞高表達(dá)Lyve1, Cd163, Timd4, Ccl2, 6, 7, 8, 9,24, Mrc1和Lgals1绢馍。MoMFs高表達(dá)Ccr2, 各種MHC-II genes (H2-DMa, H2-DMb1, H2- Ab), Lgals3, Ccl5, Cxcl10和16, Ifit, Il1b和纖維化調(diào)節(jié)基因Spp1, Thbs1和Fn1 (fibronectin 1)。
Fig 3C：兩類巨噬細(xì)胞marker基因的DimPlot
Supplemental Fig 3B：IPA富集分析顯示和MoMFs相比肠套，Resident MP富集到了心臟肥厚信號(hào) 通路舰涌。
Fig 3D：IPA轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)提示和MoMFs相比，Resident MP出現(xiàn)上游regulators IL10RA, IL4, STAT3, IRF2的激活你稚，IFNG, IRF3,IRF7出現(xiàn)抑制瓷耙。
Supplemental Fig 3C：是對(duì)Fig 3D的分cluster分析驗(yàn)證。Fig 3D是把兩種細(xì)胞的各四個(gè)cluster合在一起分析刁赖，Supplemental Fig 3C是每個(gè)cluster分開(kāi)分析搁痛，提示每個(gè)巨噬細(xì)胞都有獨(dú)特的活化方式。
Fig 3E F：前面是組織原位巨噬和MoMF的對(duì)比分析宇弛，這里作者也做了Sham和TAC巨噬對(duì)比的差異基因和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)鸡典。
小結(jié)： These results highlight key changes that occur within resident macrophages and MoMFs as the heart transitions from an adaptive hypertrophic state towards HF.
4. α-CD115–Mediated Macrophage Depletion Preferentially Affects Resident mφs
為了探究巨噬細(xì)胞是否在早期心臟應(yīng)對(duì)壓力負(fù)荷時(shí)出現(xiàn)的獲得性肥厚反應(yīng)中起到重要的作用，作者使用了monoclonal α-CD115 antibody清除了巨噬細(xì)胞枪芒。
??????monoclonal α-CD115 antibody可以block CSF-1和表達(dá)CD115的細(xì)胞結(jié)合彻况，引起髓系細(xì)胞清除。
Fig 4A：巨噬清除流程圖
Fig 4B：作者首先檢測(cè)了一下清除效率(day 0)舅踪。在注射了α-CD115或isotype control antibodies 7天之后(做TAC的時(shí)候)纽甘，使用流式檢測(cè)了組織原位巨噬和和MoMF。α-CD115抗體對(duì)組織原位巨噬的有一個(gè)優(yōu)先的清除效果硫朦，也清除掉了部分的MoMF贷腕。盡管和未給抗體組相比，給了抗體之后TAC引起的MoMF增加在TAC day3的時(shí)候還比較少咬展，但在TAC后day7的時(shí)候泽裳，給抗體組的MoMF已經(jīng)恢復(fù)到和未給抗體組差不多的水平。但是組織原位巨噬細(xì)胞被持續(xù)清除破婆。
外周血中的單核在第二次給抗體后4天就恢復(fù)了（附件）涮总，提示心臟中MoMFs的恢復(fù)依賴于外周血循環(huán)的quick replenishment。
Fig 4C：在驗(yàn)證了抗體對(duì)組織原位巨噬細(xì)胞的清除效果之后祷舀，作者對(duì)注射了α-CD115或isotype control antibodies的小鼠進(jìn)行了TAC瀑梗，并取TAC后7天的心臟進(jìn)行了CyTOF檢測(cè)烹笔。和isotype組相比，TAC組小鼠心臟巨噬出現(xiàn)了非常明顯的下降抛丽。
Fig 4D：隨后作者使用免疫熒光檢測(cè)了組織原位巨噬細(xì)胞marker CD163的表達(dá)谤职，結(jié)果提示TAC后小鼠心臟中組織原位巨噬細(xì)胞出現(xiàn)明顯增加，在α-CD115抗體清楚后出現(xiàn)顯著下降亿鲜。
Fig 4E：盡管成功清除了心臟組織原位巨噬細(xì)胞允蜈，TAC后七天小鼠沒(méi)有檢測(cè)到明顯的心肌肥厚，也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的EF蒿柳，F(xiàn)S的改變饶套。
這些結(jié)果提示α-CD115抗體可以有效清除組織原位巨噬細(xì)胞，而MoMFs則不受影響垒探。
小結(jié)：清除組織原位巨噬細(xì)胞不影響1w TAC鼠的心臟肥厚和心功能妓蛮，但不排除清除組織原位巨噬細(xì)胞仍然可能參與壓力負(fù)荷下晚期心功能失代償。
5. Resident Macrophages Inhibit Fibrosis
盡管組織原位巨噬細(xì)胞似乎在心臟應(yīng)對(duì)壓力負(fù)荷的早期肥厚過(guò)程中可有可無(wú)圾叼，但已有文獻(xiàn)顯示它們?nèi)匀豢赡茉谠黾游⒀苊芏群屠w維化過(guò)程中起到重要作用蛤克。所以接下來(lái)作者探究了心臟巨噬細(xì)胞對(duì)血管生成和纖維化的調(diào)控作用。
Fig 5A：作者分離了Sham和TAC小鼠的心臟巨噬細(xì)胞褐奥，使用流式檢測(cè)了它們促炎細(xì)胞因子TNF-α, IL6和IL10的表達(dá)咖耘。TAC小鼠心臟巨噬細(xì)胞出現(xiàn)了IL-6和IL-10的高表達(dá)，提示總體的炎癥激活撬码。
Fig 5B：TAC小鼠心臟巨噬細(xì)胞促纖維化指標(biāo)Tgfb1的表達(dá)也增加
Fig 5C D：隨后作者檢測(cè)了是否清除組織原位巨噬細(xì)胞可以影響TAC后纖維化的發(fā)生儿倒。結(jié)果顯示TAC鼠心臟和Sham相比出現(xiàn)明顯纖維化，但清除心臟組織原位巨噬之后心臟纖維化加重呜笑。
Fig 5E：為了探究是TAC后的巨噬釋放了哪些因子促進(jìn)了纖維化的發(fā)生夫否，作者分離了巨噬細(xì)胞使用bead-based immunoassay檢測(cè)了十個(gè)分子的表達(dá)。結(jié)果提示和Sham鼠相比叫胁，TAC鼠心臟巨噬細(xì)胞多種細(xì)胞因子表達(dá)都出現(xiàn)了增加凰慈，包括TGFβ1和IL10這兩種既往報(bào)道和纖維化相關(guān)的分子。
Fig 5F：TGFβ1和IL10這兩種細(xì)胞因子都可以刺激myofibroblast分化驼鹅，成熟和纖維產(chǎn)生微谓，而且是劑量依賴性的。
小結(jié)：Together, these results show that cardiac macrophages play a critical role in ameliorating fibrosis in response to pressure overload.
6. Resident Macrophages Stimulate Angiogenesis
探究心臟巨噬細(xì)胞是否影響血管生成
Fig 6A：TAC鼠心臟巨噬細(xì)胞Vegfa表達(dá)增加
Fig 6B：TAC鼠血管生成增加输钩，清除組織原位巨噬后血管生成減少
Fig 6C：為了驗(yàn)證巨噬細(xì)胞對(duì)血管生成的直接作用豺型，作者分離了TAC鼠心臟巨噬細(xì)胞和HUVECs（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）共培養(yǎng)。結(jié)果顯示macrophages stimulated tube formation with increases in mesh area, and number of nodes, junctions, and meshes compared with the negative control买乃，而且這個(gè)效應(yīng)也是劑量依賴性的姻氨。
小結(jié)：These results show that cardiac macrophages promote vascular growth in pressure-overloaded hearts.
7. Recruited Monocyte-Derived Macrophages Stimulate Fibrosis
前面觀察到α-CD115抗體主要清除組織原位巨噬細(xì)胞而且α-CD115抗體treated TAC小鼠出現(xiàn)纖維化加重的表現(xiàn)。但α-CD115也可以部分清除MoMF剪验，因此作者推測(cè)MoMF可能也參與了TAC后纖維化的發(fā)生肴焊。
Fig 7A：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)前联。
Fig 7B：流式檢測(cè)注射了α-CD115或isotype control antibodies的C57和CCR2 KO的TAC鼠心臟。CCR2KO鼠心臟的MoMF明顯缺陷娶眷。
Fig 7C：早期清除組織原位巨噬細(xì)胞對(duì)心臟早期肥厚和心功能影響不大似嗤，和前面的結(jié)論一致。
Fig 7D：給了α-CD115的c57鼠纖維化增加届宠，和前面結(jié)論一致双谆。但α-CD115–treated CCR2KO 鼠（缺乏組織原位巨噬和MoMF）纖維化水平反而出現(xiàn)了下降。
小結(jié)：These findings indicate that recruited MoMFs are strong promoters of cardiac fibrosis in a process that ultimately depends on the counteracting role of resident macrophages.
8. Depletion of Resident Macrophages Leads to Accelerated HF Development
前面做的都是清除巨噬的短期效果席揽，這里作者也對(duì)長(zhǎng)期效應(yīng)(TAC 6w)做了檢測(cè)。
Fig 8A：對(duì)注射了α-CD115或isotype control antibodies的TAC 6w心臟進(jìn)行了質(zhì)譜流式檢測(cè)谓厘，各類細(xì)胞數(shù)目已經(jīng)沒(méi)有明顯差別幌羞。
Fig 8B：各類巨噬亞群的比例也沒(méi)有差別
Fig 8C：但是和給了isotype control的TAC鼠相比，給了α-CD115抗體的TAC在6w時(shí)出現(xiàn)了EF和FS的進(jìn)一步惡化竟稳，但心臟肥厚沒(méi)有加重属桦。
Fig 8D：盡管整體肥厚沒(méi)有加重，給了抗體的TAC鼠心肌面積更大
Fig 8E F：給了α-CD115抗體的TAC鼠心臟纖維化更重
該研究中他爸，研究人員結(jié)合了CyTOF和scRNA測(cè)序研究了心臟負(fù)荷早期免疫細(xì)胞的重構(gòu)聂宾。研究鑒定了不同的巨噬亞群，分析了其在心臟負(fù)荷早期的亞群豐度變化及基因表達(dá)差異诊笤，確定了Res MPs和MoMFs在心臟負(fù)荷早期調(diào)節(jié)中的重要作用系谐。隨后研究人員通過(guò)a-CD115抗體清除Res MPs，發(fā)現(xiàn)Res MPs耗竭會(huì)導(dǎo)致心臟中血管的生成反應(yīng)減弱讨跟，心臟的纖維化程度會(huì)增加纪他。盡管后續(xù)巨噬細(xì)胞得以恢復(fù)，但是早期耗盡巨噬細(xì)胞的心臟依舊出現(xiàn)了心臟功能的降低和纖維化晾匠，說(shuō)明心臟中的Res MPs在早期抑制纖維化和預(yù)防心力衰竭中就有著重要的作用茶袒。而使用a-CD115抗體干預(yù)CCL2敲除鼠同時(shí)清除Res MPs和MoMFs則心臟纖維化程度減輕，揭示了MoMFs的強(qiáng)促纖維化作用凉馆。該研究為更好地理解心臟巨噬細(xì)胞刺激和補(bǔ)償調(diào)節(jié)機(jī)制以及心衰的靶向治療提供了參考薪寓。
