RNA-Seq簡介

舉個例子，現(xiàn)在我們有一群正常的神經(jīng)細胞，一群突變的神經(jīng)細胞涉馅，突變細胞的行為與正常細胞不同。我們想知道是什么遺傳機制造成了這種差異黄虱，這意味著我們想要觀察基因表達的差異稚矿。每一個細胞有一堆染色體(chromosomes),每一個染色體上有一堆基因，有一些基因是活躍的捻浦，有的是不活躍的晤揣，高通量測序告訴我們哪些基因是活躍的，以及轉(zhuǎn)錄了多少朱灿。我們可以使用RNA-Seq去檢測正常細胞和突變的細胞中的基因表達昧识。然后我們就可以比較這兩種細胞類型，在突變細胞中找出它們的不同之處盗扒。

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RNA-Seq分三個主要的步驟：

1. 準備一個測序文庫

2. 測序

3. 數(shù)據(jù)分析

1.準備一個測序文庫

注意:我使用Illumina協(xié)議(protocol)和測序儀(sequencer)作為我的例子跪楞，因為他們是常用的，但記住侣灶，有其他協(xié)議和測序儀是不同的甸祭。

第一步：分離RNA

第二步：將RNA打斷成小片段

我們這樣做是因為RNA轉(zhuǎn)錄本可以有數(shù)千個堿基長，但測序機只能對較短的片段(200-300 bp)進行測序褥影。

第三步:將RNA片段轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA池户。

雙鏈DNA比RNA更穩(wěn)定，易于擴增和修飾(modified)。

第四步:添加測序接頭(adaptors)校焦。

接頭做兩件事：

1. 允許測序儀識別片段赊抖。

2. 允許你同時測序不同的樣品，因為不同的樣品可以使用不同的接頭

注意：這個步驟并不是100%有效的

第五步:PCR擴增

只有具有測序接頭的片段被放大;他們是豐富的寨典。

第六步:QC

1. 驗證文庫濃度

2. 驗證文庫片段長度

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2.測序

想象一下我們要測序的DNA片段熏迹，它是垂直的，因為它在測序儀里就是這樣的凝赛。實際上注暗，大約有4億個片段垂直排列在一個網(wǎng)格中。我只是給你看4個片段墓猎，網(wǎng)格(grid)捆昏，我們叫做流動池(flow cell),這臺機器有熒光探針，不同顏色的探針結(jié)合不同的核苷酸(nucleotide)毙沾。探針連接到每個序列的第一個堿基上骗卜。一旦探針連接好，機器就會從上面給流動池拍照左胞。這幅圖告訴機器左下角的第一個堿基是“A”寇仓，右下角為‘’G‘’，后方還有兩個‘’A‘’烤宙。然后機器會洗掉探針的顏色遍烦，然后探針被綁定到每個片段中的下一個堿基上，重復以上步驟躺枕。這個過程不斷重復服猪，直到機器確定每個核苷酸序列。

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有時拐云，探針的亮度不高罢猪，機器也不確定自己判斷的是正確的顏色，質(zhì)量分數(shù)(Quality scores)是輸出的一部分叉瘩，反映了機器對堿基識別的自信程度膳帕，在這種情況下，褪色的點會得到低質(zhì)量得分薇缅。

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你可能會得到低質(zhì)量分數(shù)的另一個原因是危彩，在同一區(qū)域有許多相同顏色的探針，這被稱為“低多樣性”捅暴，單一顏色的過多會使識別單個序列變得困難恬砂，顏色會模糊在一起咧纠。

每個測序“read”包含4行數(shù)據(jù)蓬痒。第一行(總是以@'開始)是序列的唯一ID。第二行包含序列片段的堿基漆羔。第三行總是一個“+”字符梧奢。第四行包含序列片段中每個堿基的質(zhì)量得分狱掂。

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現(xiàn)在我們了解了原始數(shù)據(jù)以及它是如何生成的，我們需要:

1.過濾掉垃圾reads

• reads含有低質(zhì)量的堿基

• read顯然是化學反應的產(chǎn)物(接頭序列)

2.將高質(zhì)量的reads與基因組比對

• 匹配read片段的基因組片段將決定一個位置(染色體和位置)在基因組中亲轨。

3.計算每個基因的reads

• 一旦我們知道染色體和位置趋惨，我們可以看到它是否在一個基因的坐標(或其他一些有趣的特征)。

• 在你計算每個基因的讀數(shù)之后惦蚊，你會得到一個像這樣的數(shù)字矩陣

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在分析之前我們做的最后一件事是標準化數(shù)據(jù)器虾。這是因為每個樣本都有不同的reads，這是由于一個樣本可能有更多低質(zhì)量的reads蹦锋，或者另一個樣本可能在流動池上的濃度稍高兆沙。舉個例子，樣本1有635reads莉掂，樣本2有1270reads葛圃。這并不意味著樣本2中的基因轉(zhuǎn)錄量是樣本1的兩倍。相反憎妙，這意味著樣品2有較少的低質(zhì)量reads库正，可能比樣品1在流動池上有更多的點。然而厘唾，從reads來看褥符，樣本2的基因轉(zhuǎn)錄量似乎是樣本1的兩倍。因此抚垃，我們需要調(diào)整每個基因的read属瓣，以反映分配給每個樣本的reads的差異。最簡單的方法就是用每個基因的reads除以每個樣本的總reads讯柔。然而抡蛙，還有許多更復雜的方法可以做到這一點。

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3.數(shù)據(jù)分析

第一步：任何數(shù)據(jù)分析的第一步是相同的魂迄，繪制數(shù)據(jù)

我們需要一張有20,000個軸的圖表來繪制原始數(shù)據(jù)粗截，所以我們使用PCA(主成分分析)或者類似的方法來繪制這些數(shù)據(jù)。PCA減少了顯示數(shù)據(jù)重要方面所需的軸數(shù)捣炬。這是一個在神經(jīng)細胞上做的RNA-seq實驗的PCA圖熊昌。“wt”樣本是“正常的”湿酸⌒鲆伲“ko”樣本是研究人員突變的樣本⊥评＃“ko”樣品在角落里形成了一個漂亮的小簇昂利。“wt”樣本都在左側(cè)，但分布在y軸上蜂奸。這些圖的繪制方式犁苏，最重要的區(qū)別是在x軸上，在y軸的區(qū)別不重要扩所，這意味著“wt”和“ko”樣本之間的差異最大围详，然而，當我們做進一步分析時祖屏，我們可能希望排除“wt2”助赞。

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總結(jié)：

1. 告訴我們是否可以期待發(fā)現(xiàn)有趣的差異。

2. 告訴我們是否應該從下游分析中排除一些樣品袁勺。

第二步：鑒定“正臣倒眨”和“突變”樣本之間的差異表達基因

這通常使用edgeR或DESeq2來完成，結(jié)果通常使用這種圖表來顯示魁兼。

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• 如果你知道你在尋找什么婉徘，你就可以看看實驗是否驗證了你的假設。

• 如果你不知道你在尋找什么咐汞，你可以看到某些通路富集在正掣呛簦或突變基因集。