Evaluation of stromal cell infiltration in the tumor microenvironment enable prediction of treatment sensitivity and prognosis in colon cancer
評(píng)價(jià)腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)可預(yù)測(cè)結(jié)腸癌的治療敏感性和預(yù)后
發(fā)表期刊：Comput Struct Biotechnol J
發(fā)表日期：2022 Apr 30
DOI:? 10.1016/j.csbj.2022.04.037
一萧落、背景
????????結(jié)腸癌是一種以相當(dāng)大的分子異質(zhì)性為特征的疾病花履，與預(yù)后和治療效果有關(guān)办成。大量文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)了各種類(lèi)型癌癥的腫瘤微環(huán)境（TME）特征的臨床重要性。對(duì)于結(jié)腸癌來(lái)說(shuō)毕源，一個(gè)共識(shí)的免疫分?jǐn)?shù)，已經(jīng)被證明是一個(gè)獨(dú)立于TNM分期的強(qiáng)有力的預(yù)后指標(biāo)窄锅，從而使結(jié)腸癌成為免疫分類(lèi)的典型腫瘤藻肄。除了預(yù)后價(jià)值明吩，免疫分?jǐn)?shù)也被發(fā)現(xiàn)是ADJC性能的參考因素间学。
????????共識(shí)免疫分?jǐn)?shù)是通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)的，這種方法嚴(yán)重依賴(lài)有限的表型標(biāo)志物庫(kù)和足夠大小的活檢標(biāo)本印荔。換句話(huà)說(shuō)低葫，免疫組化染色只能反映有限的細(xì)胞類(lèi)型，因此大部分關(guān)于TME全景特征的信息被忽略了仍律。此外嘿悬，免疫組化染色通常應(yīng)用于分析特定的二維組織切片，所以它不能用來(lái)估計(jì)整個(gè)三維組織樣本的TME含量水泉。
二善涨、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來(lái)源
1） 結(jié)腸癌樣本的公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是從GEO和TCGA-COAD數(shù)據(jù)集中回顧性收集的：GSE39582窒盐、TCGA-COAD
2） 來(lái)自中山大學(xué)癌癥中心隊(duì)列的樣本：30個(gè)組織學(xué)上診斷為非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)
3） 從UCSC Xena Data Porta下載了TCGA數(shù)據(jù)集中的11種實(shí)體瘤的泛癌歸一化RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，以探索SIIS模型的廣泛適用性
2.實(shí)驗(yàn)流程
1） 基于31種基因的定量指標(biāo)的產(chǎn)生：設(shè)計(jì)了一個(gè)四階段的篩選策略钢拧，以篩選出有信息量的基因來(lái)建立“基質(zhì)浸潤(rùn)強(qiáng)度評(píng)分（SIIS）”蟹漓；彈性網(wǎng)分析、Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型源内、LASSO葡粒；使用 "LIMMA "包進(jìn)行集群之間的差異表達(dá)基因（DEG）分析
2） SubMap和最近的模板預(yù)測(cè)（NTP）分析：SubMap分析和NTP分析被用來(lái)探索SIIS和TMECS算法的內(nèi)部關(guān)系，通過(guò)GenePattern網(wǎng)站的在線(xiàn)模塊實(shí)現(xiàn)
3） 預(yù)測(cè)化療反應(yīng)：使用R軟件包 "pRRophetic"膜钓，它分別基于CTRP數(shù)據(jù)庫(kù)和GDSC數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)現(xiàn)了內(nèi)置的脊回歸模型
4） 路徑嗽交、免疫和代謝評(píng)分的估計(jì)：GSVA、ssGSEA颂斜；每個(gè)腫瘤樣本中的新陳代謝激活狀態(tài)和其他流行的基因特征水平是用IOBR軟件包確定的
5） 多組學(xué)分析：突變分析夫壁、蛋白質(zhì)組學(xué)分析
6） CRISPR協(xié)同激活介體庫(kù)篩選鑒定化療抗性基因、CRISPR/Cas9敲除庫(kù)篩選
7） 連接圖分析：根據(jù)Cmap網(wǎng)站提供的說(shuō)明沃疮，使用折返變化最明顯的150個(gè)基因(上調(diào)和下調(diào))進(jìn)行連接圖(Cmap)分析掌唾。
8） 體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01 - 識(shí)別與化療獲益相關(guān)的不同的TME群組
????????利用無(wú)監(jiān)督的分層聚類(lèi)分析（圖1A）忿磅，根據(jù)meta-GEO隊(duì)列中的990個(gè)樣本確定了三個(gè)不同的TME集群，分別表示為腫瘤微環(huán)境細(xì)胞亞型1（TMECS1凭语；n = 369）葱她、腫瘤微環(huán)境細(xì)胞亞型2（TMECS2；n = 218）和腫瘤微環(huán)境細(xì)胞亞型3（TMECS3似扔；n = 403）吨些。如圖1B和1C所示，TMECS1的特點(diǎn)是富含最高水平的基質(zhì)細(xì)胞和具有免疫抑制特性的先天性免疫細(xì)胞（這些細(xì)胞類(lèi)型被歸入細(xì)胞群1）炒辉，中等水平的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞和活化樹(shù)突狀細(xì)胞（這些細(xì)胞類(lèi)型被歸入細(xì)胞群2）豪墅，以及最低水平的Th2細(xì)胞、中央記憶T細(xì)胞和總T輔助細(xì)胞（這些細(xì)胞類(lèi)型被歸入細(xì)胞群3）黔寇，這被認(rèn)為是免疫排斥的表型偶器。與TMECS1相比，TMECS2的細(xì)胞群2和3浸潤(rùn)的豐度明顯較高缝裤，而細(xì)胞群1浸潤(rùn)明顯減少屏轰，表明TMECS2的TME特征被認(rèn)為是免疫炎癥表型[13]。與TMECS1和TMECS2不同憋飞，TMECS3的細(xì)胞群1和2的豐度估計(jì)都是最低的霎苗，這與以前報(bào)道的免疫-缺失表型密切相關(guān)。而細(xì)胞群3的浸潤(rùn)與TMECS2的浸潤(rùn)相似榛做。
????????在TMECS與結(jié)腸癌分子特征的相關(guān)性方面唁盏，發(fā)現(xiàn)TMECS2在dMMR内狸、CIMP（+）、BRAF突變厘擂、CMS1和C2（CIT）腫瘤中明顯富集昆淡，而CIN（+）、CMS4驴党、C4（CIT）和C6（CIT）腫瘤在TMECS1群中比其他兩個(gè)群中更常見(jiàn)（圖1D瘪撇，E）。然而港庄，在TME群中倔既，KRAS突變或P53突變沒(méi)有明顯的差異。生存分析顯示鹏氧，在三個(gè)TME集群中渤涌，TMECS2患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）和總生存期（OS）都表現(xiàn)出突出的生存優(yōu)勢(shì)，而TMECS1則與最差的預(yù)后有關(guān)（圖1F）把还。
????????接下來(lái)实蓬，評(píng)估了TME集群與化療反應(yīng)之間的關(guān)系。只有在TMECS3群中吊履，ADJC的施用明顯降低了患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)安皱；它沒(méi)有給TMECS1或TMECS2群的患者帶來(lái)生存優(yōu)勢(shì)（圖1G）⊥а祝考慮到TMECS1患者的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)酌伊，推測(cè)ADJC未能給這些患者帶來(lái)好處可能是由于存在原發(fā)性耐藥。作者比較了TMECS1和TMECS2集群的氟尿嘧啶反應(yīng)率和幾種化療藥物的預(yù)測(cè)IC50值缀踪。結(jié)果顯示居砖，在所有集群中，TMECS1集群的患者表現(xiàn)出最低的氟尿嘧啶反應(yīng)率（圖1H）驴娃，與TMECS2集群的患者相比奏候，大多數(shù)化療藥物的估計(jì)IC50值明顯更高（圖1I）。最后唇敞，生物學(xué)分析顯示蔗草，TMECS2集群有豐富的DNA損傷修復(fù)和免疫激活的途徑，而TMECS1集群的特點(diǎn)是有多種與基質(zhì)激活厚棵、化療抵抗和癌癥進(jìn)展有關(guān)的途徑蕉世，如刺猬信號(hào)、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）婆硬、細(xì)胞色素P450代謝和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β信號(hào)（圖1J）狠轻。
02 - 在meta-GEO隊(duì)列中建立區(qū)分TMECS1患者的基因特征
????????通過(guò)兩步回歸（圖2A），產(chǎn)生了一個(gè)由31個(gè)基因組成的定量指標(biāo)彬犯，稱(chēng)為SIIS（圖2B）向楼。箱線(xiàn)圖顯示SIIS的中位數(shù)在TMECS1群中最高查吊，在TMECS2群中最低（圖2C），隨后的TME相關(guān)分析顯示SIIS和細(xì)胞群1的浸潤(rùn)之間有很強(qiáng)的正相關(guān)（圖2D湖蜕，E）逻卖，尤其是成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，表明SIIS特征可以作為測(cè)量結(jié)腸癌樣本中基質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)強(qiáng)度的定量指標(biāo)昭抒。一致的是评也，對(duì)公共結(jié)腸癌單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集的分析也顯示與其他細(xì)胞類(lèi)型相比，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的SIIS值分布更高（圖S2A-B）灭返。SIIS區(qū)分TMECS1和TMECS2以及所有其他非TMECS1（包括TMECS2和TMECS3）患者的曲線(xiàn)下面積分別為0.90和0.82（圖2F）盗迟。為了進(jìn)一步闡明SIIS和TMECS算法的內(nèi)部關(guān)系，進(jìn)行了NTP分析和SubMap分析熙含。如圖S3A和S3B所示罚缕，預(yù)測(cè)的TMECS1亞型樣本的SIIS值明顯高于預(yù)測(cè)的非TMECS1亞型（圖S3A），高SIIS組的樣本與TMECS1樣本的標(biāo)記基因表達(dá)有明顯的相似性（圖S3B）怎静。
????????作者試圖確定SIIS模型與meta-GEO隊(duì)列的臨床相關(guān)性。根據(jù)單變量（圖2G）和多變量分析夜牡，SIIS較高的患者的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)都明顯增加导饲，SIIS與OS之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系在接受ADJC的患者中明顯增加（圖2G），表明這一標(biāo)志物可能有能力表明化療的好處氯材。為了驗(yàn)證這一猜測(cè)，在GSE39582數(shù)據(jù)集中分析了SIIS硝岗、ADJC效益和化療反應(yīng)之間的關(guān)系氢哮。在氟尿嘧啶無(wú)應(yīng)答組中SIIS的中位數(shù)明顯較高，ADJC的效益隨著SIIS的增加而明顯下降型檀，特別是在II期的患者中（圖2H-J）冗尤。同樣，在GDSC的8種化療藥物方面胀溺，高SIIS組表現(xiàn)出明顯高于低SIIS組的估計(jì)IC50（圖2K）裂七，并與晚期、pMMR仓坞、CIN（+）背零、C4（CIT）、CMS4以及基質(zhì)和抗化療途徑的激活相關(guān)（圖2L-M）无埃。
03 - 對(duì)SIIS特征的作用進(jìn)行驗(yàn)證
????????使用TCGA-COAD數(shù)據(jù)集（n = 382）進(jìn)一步評(píng)估了SIIS特征的性能徙瓶。與meta-GEO的結(jié)果一致毛雇，SIIS值在預(yù)測(cè)的TMECS1亞型中也明顯升高，TCGA-COAD數(shù)據(jù)集中高SIIS組樣本的轉(zhuǎn)錄組特征與meta-GEO中TMECS1亞型的樣本密切相關(guān)侦镇。此外灵疮，在TCGA-COAD隊(duì)列中，SIIS值也與基質(zhì)成分浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)（圖3A）壳繁，高SIIS組在TCGA-COAD隊(duì)列中表現(xiàn)出與meta-GEO隊(duì)列中相似的分子特征和代謝特征（圖3B震捣，E）。通過(guò)分析TCGA-COAD樣本的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)闹炉，轉(zhuǎn)錄組水平上的路徑富集結(jié)果在蛋白質(zhì)水平上得到進(jìn)一步證實(shí)（圖3C）蒿赢。
????????利用從Thorsson等人的研究中獲得的幾個(gè)已知的特征，進(jìn)一步測(cè)試了TCGA隊(duì)列中SIIS的相關(guān)性剩胁。與研究結(jié)果一致诉植，高SIIS組的患者表現(xiàn)出明顯較高的EMT、TGF-β和瘤內(nèi)異質(zhì)性分?jǐn)?shù)昵观，而與腫瘤純度相關(guān)的分?jǐn)?shù)都下調(diào)（圖3D）晾腔。然而，不同SIIS組之間在腫瘤突變負(fù)擔(dān)或新抗原數(shù)量方面沒(méi)有明顯差異（圖3D）啊犬。在臨床上灼擂，較高的SIIS不僅表明死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，而且化療的生存效益也減少了（圖3F觉至，G）剔应。最后，藥物反應(yīng)分析表明语御，在對(duì)TCGA-COAD數(shù)據(jù)集的分析中峻贮，較高的SIIS也明顯與氟尿嘧啶無(wú)應(yīng)答特征（圖3H）和多種化療藥物的估計(jì)IC50升高（圖3I）相關(guān)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了SIIS特征在預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者的不利預(yù)后和化療抗性方面的穩(wěn)健性应闯。
????????除了meta-GEO和TCGA-COAD隊(duì)列外纤控，還在SYSUCC隊(duì)列中驗(yàn)證了SIIS的作用。與meta-GEO和TCGA-COAD數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果一致碉纺，在預(yù)測(cè)的TMECS1中SIIS值分布較高（圖S3A）船万，高SIIS組與TMECS1的轉(zhuǎn)錄組相似（圖S3B），在這個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中也可以觀察到細(xì)胞群1的浸潤(rùn)骨田，基質(zhì)相關(guān)和化療抗性途徑的激活耿导，氟尿嘧啶不反應(yīng)狀態(tài)和CMS4亞型的豐富（圖3J-M）。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了SIIS反映結(jié)腸癌基質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)強(qiáng)度的性能态贤，從而顯示了強(qiáng)大的可重復(fù)性舱呻。
04 - 探討SIIS特征在泛癌癥中的作用
????????作者評(píng)估了SIIS在各種癌癥中的作用，選擇了11個(gè)TCGA隊(duì)列（BLCA悠汽、BRCA狮荔、CESC胎撇、ESCA、HNSC殖氏、LIHC晚树、LUAD、LUSC雅采、READ爵憎、SKCM、STAD）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行泛癌癥分析婚瓜。在SIIS值的TME特征和轉(zhuǎn)錄組特征方面宝鼓，發(fā)現(xiàn)SIIS值與基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）和肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度巴刻，以及TGF-β反應(yīng)得分和EMT特征的激活呈正相關(guān)愚铡，但與分析的所有癌癥隊(duì)列中的T輔助細(xì)胞總數(shù)呈負(fù)相關(guān)（圖4A）。這些結(jié)果表明胡陪，SIIS評(píng)分也可以作為泛癌基質(zhì)成分的一個(gè)有效的定量工具沥寥。然而，與結(jié)腸癌隊(duì)列分析結(jié)果不同的是柠座，BRCA邑雅、CESC、HNSC妈经、LUAD和SKCM的SIIS值與細(xì)胞毒性細(xì)胞浸潤(rùn)和IFNγ信號(hào)傳遞呈明顯的負(fù)相關(guān)（圖4A)淮野。
????????至于SIIS與化療藥物敏感性之間的關(guān)系，結(jié)果顯示在BLCA吹泡、BRCA骤星、CESC、HNSC爆哑、LUAD妈踊、LUSC、SKCM和STAD隊(duì)列中泪漂，高SIIS組的6種以上藥物的預(yù)測(cè)IC50值明顯增加。值得注意的是歪泳，在這些腫瘤類(lèi)型中萝勤，SIIS模型對(duì)化療耐藥性的指示作用在HNSC可能是最強(qiáng)的，因?yàn)樗谢熕幬锏膖統(tǒng)計(jì)量都大于5（7種藥物的t統(tǒng)計(jì)量都大于10）呐伞。有趣的是敌卓，多西他賽在高SIIS組的預(yù)測(cè)IC50的下調(diào)只能在BRCA、ESCA和LIHC隊(duì)列中觀察到伶氢，這表明多西他賽作為高SIIS組患者的潛在藥物選擇作用可能高度依賴(lài)于癌癥類(lèi)型趟径。然后探討了SIIS模型對(duì)這些癌癥的生存影響瘪吏。如圖4B所示，10個(gè)隊(duì)列（ESCA除外）當(dāng)患者具有較高的SIIS時(shí)蜗巧，死亡率風(fēng)險(xiǎn)增加掌眠；然而，其中只有三個(gè)隊(duì)列（BLCA幕屹、SKCM和STAD）達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）蓝丙。最后，比較了SIIS在不同腫瘤類(lèi)型中的分布（圖4C）望拖，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌和乳腺癌分別是SIIS分布最低和最高的腫瘤類(lèi)型渺尘。進(jìn)一步獲得了TCGA-BRCA數(shù)據(jù)庫(kù)中記載的PAM50亞型信息：腔鏡A亞型患者的SIIS中值最高，而基底樣疾菜得簟（也稱(chēng)為三陰性乳腺癌）患者的SIIS中值最低（圖4D）鸥跟。據(jù)報(bào)道，基底樣亞型對(duì)化療敏感盔沫；因此医咨，這些結(jié)果進(jìn)一步表明，SIIS可能能夠預(yù)測(cè)乳腺癌患者的化療療效迅诬。
????????最近有證據(jù)證明腋逆，基質(zhì)細(xì)胞富集、TGF-β信號(hào)激活和EMT途徑引發(fā)的免疫排斥表型與免疫治療缺乏反應(yīng)有關(guān)侈贷〕颓福考慮到泛癌癥隊(duì)列中SIIS和基質(zhì)激活之間的緊密聯(lián)系，作者接下來(lái)調(diào)查了SIIS特征是否能預(yù)測(cè)實(shí)體瘤的免疫治療效果俏蛮。分析了四個(gè)獨(dú)立的免疫治療隊(duì)列撑蚌，每個(gè)隊(duì)列中有超過(guò)50個(gè)樣本。在所有隊(duì)列中搏屑，較高的SIIS與較低的治療反應(yīng)率明顯相關(guān)（圖4E-H）争涌。此外，生存數(shù)據(jù)顯示辣恋，低SIIS組接受免疫治療的患者的無(wú)進(jìn)展生存期（GSE176307）和總生存期（Imvigor210）比高SIIS組的患者明顯延長(zhǎng)亮垫。不同分子特征的轉(zhuǎn)移性尿路癌患者的SIIS分布比較顯示，免疫排斥表型伟骨、低TMB和低NEO組的SIIS明顯高于其他組（圖4I饮潦，J）。從TCGA亞型比較來(lái)看（圖4J）携狭，SIIS在 "浸潤(rùn) "亞型患者中最高继蜡，在基因組不穩(wěn)定患者中最低。然而，盡管SIIS在FGFR突變體亞組（圖4I）和免疫細(xì)胞上PD-L1高表達(dá)的亞組（圖4J）中趨于下降稀并，但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異仅颇。最重要的是，這四個(gè)免疫治療隊(duì)列的結(jié)果表明碘举，SIIS與免疫療法的反應(yīng)有關(guān)忘瓦，可以進(jìn)一步預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。
05 - 多組學(xué)分析
????????為了揭示高SIIS組患者內(nèi)在化療抵抗的潛在機(jī)制殴俱，在TCGA-COAD隊(duì)列中進(jìn)行了基因組分析政冻。有17個(gè)基因的突變頻率在高、低SIIS組患者之間有明顯差異线欲，其中4個(gè)基因在高SIIS組的突變頻率較高明场，其余13個(gè)基因的突變主要在低SIIS組富集（圖5A）。這些基因的共同出現(xiàn)狀況見(jiàn)圖5B李丰。通過(guò)t檢驗(yàn)分析苦锨，發(fā)現(xiàn)在這13個(gè)低SIIS相關(guān)的差異突變基因中，有12個(gè)基因（除SMAD4外）的突變狀態(tài)與氟尿嘧啶敏感性顯著相關(guān)趴泌。進(jìn)一步根據(jù)這12個(gè)基因的突變狀態(tài)構(gòu)建了一個(gè)綜合突變?cè)u(píng)分：如果患者在這些基因中的任何一個(gè)有突變舟舒，將被計(jì)入1分。如圖5D-F所示嗜憔，隨著突變分?jǐn)?shù)的增加秃励，SIIS值（圖5D-E）和氟尿嘧啶無(wú)反應(yīng)率（圖5F）都有所下降。接下來(lái)的生存分析顯示吉捶，這些基因沒(méi)有突變的患者（突變分?jǐn)?shù)為0）不能從ADJC中獲益（圖5G）夺鲜。綜上所述，這些結(jié)果表明呐舔，缺乏基因突變是造成SIIS高分患者化療耐藥的機(jī)制之一币励。
????????除了基因組突變外，還探討了基因啟動(dòng)子甲基化水平與SIIS值之間的相關(guān)性珊拼。通過(guò)對(duì)DNA啟動(dòng)子甲基化情況的全面調(diào)查食呻，我們發(fā)現(xiàn)共有125個(gè)探針具有高變異性，其檢測(cè)的β值與SIIS值顯著相關(guān)澎现。注意到有5個(gè)探針針對(duì)ADCY4基因的啟動(dòng)子區(qū)域仅胞，由cg14287235檢測(cè)的甲基化水平與SIIS值顯示出最強(qiáng)的相關(guān)性（圖5H），在隨后的分析中重點(diǎn)關(guān)注ADCY4剑辫。如圖5I和5J所示干旧，相關(guān)分析顯示，ADCY4的甲基化與基質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)和EMT及TGFβ途徑的激活水平顯著負(fù)相關(guān)揭斧，而其轉(zhuǎn)錄表達(dá)與這些基質(zhì)相關(guān)特征正相關(guān)。然而，ADCY4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和甲基化之間的關(guān)聯(lián)很弱讹开，這表明ADCY4甲基化對(duì)生物學(xué)行為的影響可能不是通過(guò)影響其轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)的盅视。最后，化療療效分析結(jié)果也表明旦万，對(duì)氟尿嘧啶無(wú)應(yīng)答的患者闹击，ADCY4的甲基化水平明顯下降（圖5K），只有ADCY4甲基化程度高的患者（β值>0.5）才傾向于從ADJC中獲益（圖5L）成艘。
06 - GPX3和PRICKLE2被確定為高SIIS組患者化療耐藥的驅(qū)動(dòng)基因
????????為了確定參與高SIIS患者化療抗性的關(guān)鍵基因断箫，作者利用人類(lèi)基因組規(guī)模的CRISPR/CAS9 SAM2集合庫(kù)對(duì)SW480細(xì)胞進(jìn)行了功能增益篩選，40μM的奧沙利鉑和2μM的5-氟尿嘧啶（5-FU）作為有效選擇壓力（圖6A，B）暂刘。從這個(gè)篩選中，發(fā)現(xiàn)有488個(gè)sgRNAs子集在奧沙利鉑處理的細(xì)胞中明顯富集（圖6C芝发，上），而與對(duì)照相比，279個(gè)sgRNAs在5-FU處理的細(xì)胞中明顯富集（圖6C刻炒，下），表明這些sgRNAs靶向的基因可能是氟尿嘧啶或奧沙利鉑抗性的潛在驅(qū)動(dòng)因素晒喷。通過(guò)對(duì)SIIS和這些潛在驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，在GSE39582和TCGA-COAD隊(duì)列中共發(fā)現(xiàn)了31個(gè)與SIIS明顯正相關(guān)的基因（圖6C-E）。在這些基因中，GPX3和PRICKLE2引起了特別的注意，因?yàn)樗鼈兪莝gRNA在奧沙利鉑治療和5-FU治療的人群中同時(shí)顯著增加的交叉基因耘沼，并且在GSE39582和TCGA-COAD隊(duì)列中高SIIS組的樣本中表達(dá)增加（圖6F）。臨床相關(guān)性分析表明狂秘，較高的GPX3和PRICKLE2表達(dá)反映了RFS和OS的不良結(jié)果，特別是對(duì)于接受ADJC的患者（圖6G钱烟，左）拴袭。此外，ADJC增加了高GPX3和高PRICKLE2組患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)（圖6G吴汪，右）。Boxplots顯示，GPX3和PRICKLE2的mRNA表達(dá)在氟尿嘧啶無(wú)反應(yīng)組和CMS4亞型組明顯升高（圖6H，I）。通路和免疫分析證實(shí)座韵，在GS39582宦棺、TCGA-COAD和SYSUCC隊(duì)列中呐芥，隨著GPX3和PRICKLE2表達(dá)的增加滨攻，細(xì)胞群1中成員的浸潤(rùn)豐度和基質(zhì)通路的激活水平明顯增加（圖6J）。
????????作者發(fā)現(xiàn)分析的所有三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中虾攻，SIIS與WNT/PCP活性水平明顯正相關(guān)（圖6K）铡买，而SIIS與β-catenin依賴(lài)的典型WNT信號(hào)之間的相關(guān)性很弱（TCGA-COAD），甚至表現(xiàn)為明顯負(fù)相關(guān)（GSE39582和SYSUCC）（圖6K）霎箍。還觀察到在GSE39582奇钞、TCGA-COAD和SYSUCC結(jié)腸癌隊(duì)列的氟尿嘧啶無(wú)反應(yīng)組和CMS4組中，WNT/PCP途徑的GSVA得分持續(xù)增加（圖6L漂坏，M）景埃∶街粒總之，這些結(jié)果表明谷徙，WNT/PCP途徑拒啰，而不是典型的WNT/β-catenin途徑，主要促成了高SIIS患者的生物學(xué)特征完慧。
????????由于GPX3是SIIS特征的成員之一谋旦，在接下來(lái)的研究中對(duì)GPX3進(jìn)行了進(jìn)一步研究。為了驗(yàn)證CRISPR文庫(kù)篩選結(jié)果屈尼，進(jìn)行了一項(xiàng)體外研究：將外源性GPX3質(zhì)敛嶙牛或針對(duì)GPX3的siRNA分別轉(zhuǎn)染到SW480和CACO2結(jié)腸癌細(xì)胞系。一致的是脾歧，外源GPX3的過(guò)表達(dá)再現(xiàn)了SW480細(xì)胞中sgRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活對(duì)5-FU和奧沙利鉑處理的化療抗性促進(jìn)作用甲捏，這一點(diǎn)通過(guò)MTT和細(xì)胞集落形成確定（圖7A）。而在體外（圖7B鞭执，C）和體內(nèi)（圖7D司顿，E）實(shí)驗(yàn)中，CACO2細(xì)胞中GPX3的下調(diào)導(dǎo)致對(duì)5-FU和奧沙利鉑的反應(yīng)急劇增加兄纺。使用石蠟包埋組織芯片檢測(cè)了GPX3在結(jié)腸癌中的表達(dá)和臨床意義（圖7G）大溜。基于蛋白質(zhì)水平估脆，還證實(shí)GPX3的高表達(dá)可以獨(dú)立識(shí)別出無(wú)病生存率較低的患者（圖7F）猎提。在化療效益方面，發(fā)現(xiàn)ADJC特別是高強(qiáng)度的化療方案（奧沙利鉑聯(lián)合旁蔼，6個(gè)月的化療锨苏，或8個(gè)周期的Xeloda），往往會(huì)增加GPX3蛋白高表達(dá)患者的復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)（圖7H棺聊，I）伞租。腫瘤分期的分層也觀察到類(lèi)似的趨勢(shì)。
????????為了確定可能是實(shí)現(xiàn)高SIIS患者化療增敏的候選分子靶點(diǎn)和化合物限佩，使用Cmap工具葵诈。在過(guò)濾結(jié)果后，在GSE39582和TCGA-COAD隊(duì)列中進(jìn)行的分析中確定了幾個(gè)最豐富的候選分子靶點(diǎn)和化合物（圖7J）祟同，化合物的作用機(jī)制見(jiàn)圖7K作喘。在交叉的分子靶點(diǎn)中，注意到SIAH2是一個(gè)上游調(diào)節(jié)器晕城，需要在缺氧條件下維持HIFα的表達(dá)水平和激活其轉(zhuǎn)錄活性泞坦，在GSE39582和TCGA-COAD隊(duì)列中都有最高的富集分?jǐn)?shù)。巧合的是砖顷，通過(guò)GPX3啟動(dòng)子區(qū)域的HIF1α結(jié)合位點(diǎn)的存在贰锁，缺氧被確定為GPX3表達(dá)的強(qiáng)大轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器赃梧。因此，在轉(zhuǎn)染了針對(duì)SIAH2的siRNA（siSIAH2）的CACO2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了SIAH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（oxSIAH2）的SW480細(xì)胞中測(cè)試GPX3的表達(dá)豌熄，發(fā)現(xiàn)通過(guò)siSIAH2和oxSIAH2轉(zhuǎn)染授嘀，GPX3的mRNA和蛋白水平明顯下降或上升（圖7L）。此外锣险，siSIAH2轉(zhuǎn)染明顯增加了CACO2細(xì)胞中由5-FU或奧沙利鉑誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量（圖7M）蹄皱，進(jìn)一步表明SIAH2調(diào)節(jié)GPX3介導(dǎo)的化療抗性。此外芯肤，測(cè)試了富集度最高的化合物的化療效果夯接，并報(bào)告了幾種抑制劑，如MLN8054纷妆、LY317615和SJ-72550，在CACO2細(xì)胞中擁有對(duì)5-FU和奧沙利鉑的化療敏感能力（圖7M）晴弃。
四掩幢、結(jié)論
????????總之，作者開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一個(gè)基于量化TME中腫瘤相關(guān)基質(zhì)成分的新型個(gè)體評(píng)分系統(tǒng)上鞠，該系統(tǒng)可作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌生存率的實(shí)用和強(qiáng)大的生物標(biāo)志物际邻，并提供更精確的治療方案。
