New evaluation of the tumor immune microenvironment of non-small cell lung cancer and its association with prognosis
非小細(xì)胞肺癌腫瘤免疫微環(huán)境的新評(píng)價(jià)及其與預(yù)后的關(guān)系
發(fā)表期刊：J Immunother Cancer
發(fā)表日期：2022 Apr 5
doi: 10.1136/jitc-2021-003765
一、背景
????????肺癌仍然是全球癌癥死亡的主要原因乍构。盡管在手術(shù)绰精、化療、放療和靶向治療方面取得了巨大進(jìn)步群扶，但5年的存活率仍不到50%及刻。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）的最新發(fā)展徹底改變了肺癌的治療，但仍然只有少數(shù)患者對(duì)單藥治療或聯(lián)合療法有反應(yīng)。因此我們需要更好地了解腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）提茁，以促進(jìn)預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的鑒定淹禾，并為肺癌患者制定更有效的治療策略。
????????不久前茴扁，Galon等人提出了基于“免疫環(huán)境”概念的腫瘤免疫系統(tǒng)狀態(tài)評(píng)估铃岔。這是對(duì)TIME中免疫細(xì)胞類型的評(píng)估，稱為“Immunoscore”峭火，對(duì)原位T細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行量化毁习，從而納入了宿主免疫反應(yīng)的影響。它已在結(jié)直腸癌中得到國(guó)際驗(yàn)證卖丸，并且比當(dāng)前基于腫瘤的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期系統(tǒng)提供更好的預(yù)后信息纺且，能有益于癌癥分類和提高預(yù)后準(zhǔn)確性，也適用于其他癌癥類型稍浆。
二载碌、材料和方法
1.數(shù)據(jù)來源
1）.113例肺癌患者的腫瘤樣本
2）.肺癌患者TCGA數(shù)據(jù)集
3）.ICI治療的黑色素瘤患者數(shù)據(jù)集 (GSE78220, GSE91061)
2.分析流程
1）.樣本DNA、RNA提取
2）.全外顯子組測(cè)序WES(n=95)和RNA測(cè)序 (n=113)
3）.TIME評(píng)分：為評(píng)估TIME中癌細(xì)胞衅枫、免疫細(xì)胞和局部免疫抑制元件之間的復(fù)雜相互作用嫁艇，基于腫瘤增殖、抗腫瘤免疫和免疫抑制三個(gè)主要因素的新評(píng)分系統(tǒng)弦撩。TIME的狀態(tài)可以通過與腫瘤增殖（T-因子）步咪、抗腫瘤免疫（I-因子）和免疫抑制（S-因子）相關(guān)的因素來描述，在分子特征數(shù)據(jù)庫（MsigDB V.7.1）或之前驗(yàn)證和報(bào)告的基因集中益楼，選擇與這些因素相關(guān)的九個(gè)代表性基因集猾漫。
4）.對(duì)來自RNA-seq的TIME中不同細(xì)胞類型進(jìn)行量化和去卷積【xCell 、quanTIseq 感凤、 CIBERSORT 】
5）.使用HLA分型軟件Omixon target HLA（Omixon）：從正趁踔埽基因組DNA的WES數(shù)據(jù)確定HLA分型和HLA I類表位結(jié)合預(yù)測(cè)HLA類型。使用Neoantimon評(píng)估來自單個(gè)HLA等位基因錯(cuò)義突變的預(yù)測(cè)候選新抗原俊扭。計(jì)算得到新抗原肽IC50<500 nmol/L和相應(yīng)的野生型肽IC50>500 nmol/L為預(yù)測(cè)新抗原表位队橙。將能夠產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)HLA-A、HLA-B或HLA-C限制性新表位的錯(cuò)義突變定義為預(yù)測(cè)新抗原（p-neoAg）萨惑。使用bam-readcount評(píng)估了RNA表達(dá)數(shù)據(jù)捐康，并計(jì)算了p-neoAgs中表達(dá)的新抗原表位（e-neoAgs）的數(shù)量。
6）.流式細(xì)胞術(shù)
7）.腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞擴(kuò)增和ELISA
8）.統(tǒng)計(jì)分析
三庸蔼、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.TIME評(píng)分與臨床特征解总、流式細(xì)胞術(shù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)的相關(guān)性
????????對(duì)來自113個(gè)腫瘤患者的RNA-seq進(jìn)行富集分析，將與有絲分裂和糖酵解相關(guān)的基因集的z-score分配給腫瘤因子（T-scores）姐仅，T細(xì)胞和B細(xì)胞以及MHC蛋白復(fù)合物被分配到抗腫瘤免疫因子（I-scores）花枫，最后刻盐，將抑制炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生、血管生成劳翰、缺氧和EMT分配給免疫抑制因子（S-scores）（圖1A）敦锌。T-scores和I-scores呈負(fù)相關(guān)，而I-scores和S-scores呈正相關(guān)（圖1C）佳簸。
????????接下來乙墙，作者研究了每個(gè)TIME分?jǐn)?shù)與臨床病理特征或流式細(xì)胞術(shù)和基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。T評(píng)分與病理分期生均、組織學(xué)分級(jí)听想、浸潤(rùn)性病變大小以及FDG-PET的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值呈正相關(guān)(圖1D)；I評(píng)分與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的腫瘤組織FTD中CD3+細(xì)胞和CD19+細(xì)胞的比例相關(guān)马胧，根據(jù)GZMA和PRF1的mRNA的表達(dá)水平估計(jì)汉买，I評(píng)分也與細(xì)胞溶解活性（CYT）相關(guān)，后者與細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤(rùn)和活性相關(guān) (圖1E)佩脊；S評(píng)分與FAP陽性細(xì)胞的頻率（與CAFs相關(guān)）以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD31+內(nèi)皮細(xì)胞的頻率相關(guān)（圖1F）蛙粘。 S評(píng)分還與從xCell推斷的M2巨噬細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的豐度以及抗炎細(xì)胞因子基因（TGFB1和IL-10）和免疫檢查點(diǎn)分子基因（CTLA4邻吞、PDCD1（PD-1）组题、HAVCR2（Tim-3）和LAG3）的表達(dá)相關(guān)葫男。以上數(shù)據(jù)表明：基于TIME的T-scores,I-scores, 和S-scores與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致抱冷，可能反映肺癌患者的臨床特征。
2.根據(jù) TIME 評(píng)分的代表性組織學(xué)和驅(qū)動(dòng)突變的分布情況
????????為研究T因子旺遮、I因子和S因子之間的動(dòng)態(tài)相互作用 ，作者將113名肺癌患者根據(jù)T-scores（T）盈咳、I-scores（I）和S-scores（S）的高低被分為八組耿眉，第一組（G1），Tlo/Ilo/Shi鱼响；第二組（G2）鸣剪，Tlo/Ilo/Slo；第三組（G3）丈积，Tlo/Ihi/Shi筐骇；以及第4組（G4），Tlo/Ihi/Slo江滨；第5組（G5）铛纬，Thi/Ilo/Shi；第6組（G6）唬滑，Thi/Ilo/Slo告唆；第七組（G7）棺弊，Thi/Ihi/Shi；第8組（G8）擒悬，Thi/Ihi/Slo模她。所有八組中每個(gè)基因組的熱圖按Z-score和臨床數(shù)據(jù)歸一化后顯示在圖2A。G1-4組（Tlo：82.5%）的腺癌發(fā)生率高于G5-8組（Thi51.8%）（圖2B左）懂牧。相比之下缝驳，Thi組的鱗狀細(xì)胞癌（30.4%）多于Tlo組（10.5%）。然而归苍，根據(jù)Ilo和Ihi或Slo和Shi狀態(tài)用狱，這些組織類型的頻率沒有顯著差異（圖2B中右）。接下來拼弃，基于WES數(shù)據(jù)（圖2C）和靶向測(cè)序數(shù)據(jù)研究了復(fù)發(fā)性驅(qū)動(dòng)突變夏伊。 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變?cè)赥lo組比Thi組更常見（圖2D左），Thi組的TP53突變頻率高于Tlo組吻氧。然而溺忧，在Ilo組和Ihi組之間，或Slo組和Shi組之間盯孙，EGFR或TP53的突變頻率也沒有差異（圖2D中右圖）鲁森。
????????與野生型EGFR相比振惰，EGFR突變型肺癌的T評(píng)分顯著更低（圖S2A）歌溉，但TP53突變型肺癌的T評(píng)分顯著更高，TP53突變型肺癌的I評(píng)分顯著更低（圖S2B）骑晶。
3.單核苷酸變異、新抗原和免疫選擇壓力?
????????突變衍生的新抗原被認(rèn)為是抗腫瘤免疫反應(yīng)和免疫編輯的關(guān)鍵靶點(diǎn)桶蛔。因此匙头，作者接下來研究了八組患者中單核苷酸突變（SNV）、p-neoAgs和e-neoAgs的數(shù)量（圖3A-C）仔雷。Thi組SNV和p-neoAgs的數(shù)量高于Tlo組（圖S3-1A蹂析，B），然而碟婆，兩組之間的e- neoAgs數(shù)量沒有顯著差異（圖S3-1C）电抚。
????????免疫選擇壓力可能會(huì)通過抑制含有新抗原的轉(zhuǎn)錄本，消除 e-neoAgs 或影響新抗原表達(dá)的腫瘤亞克隆脑融。已經(jīng)有研究表明喻频，某些免疫原性癌癥在腫瘤的全部突變中表現(xiàn)出優(yōu)先消耗新抗原突變。為了測(cè)試這一點(diǎn)是否適用于肺癌亞組肘迎，作者比較了觀察到的新抗原與預(yù)測(cè)的新抗原的比率以及每個(gè)體細(xì)胞突變的新抗原比率甥温。然而锻煌，各組之間沒有顯著差異（圖S3-2A-D和圖3D）。
????????接下來比較了e-neoAgs和p-neoAgs的比率姻蚓，將其稱為“新生抗原表達(dá)比率”（圖3E）宋梧。 盡管Thi組的這一比例略高于Tlo組（圖S3-2E），但在該分析中狰挡，I評(píng)分狀態(tài)顯示Thi/Ihi組（G7,8）的比例顯著低于Thi/Ilo組（G5,6）（圖S3-2F）捂龄。相比之下，Tlo/Ihi（G3,4）組的這一比例并不低于Tlo/Ilo（G1,2）組加叁。這些結(jié)果表明倦沧，針對(duì)新抗原mRNA表達(dá)的免疫選擇壓力可能只發(fā)生在新抗原負(fù)荷高的Thi組（G5-8），而在Thi/Ilo組（G5,6）中可能會(huì)減弱它匕。
????????作者主要關(guān)注針對(duì)新抗原的免疫選擇壓力可能最強(qiáng)的Thi（G5-8）群體豫柬。Thi/Ilo組（G5,6）的CYT評(píng)分和IFN-γmRNA低于Thi/Ihi組（G7,8）（圖3F和G,圖S8G告希，H）铛只。由IFN-γ誘導(dǎo)的 MHC I類和PD- L1的表達(dá)模式與IFN-γ表達(dá)模式相似（圖3H-J）难裆。未觀察到MHC I類表達(dá)與NK細(xì)胞評(píng)分在“missing self”識(shí)別中的負(fù)相關(guān)（圖3K）摸屠。接下來研究了用自體腫瘤細(xì)胞攻擊的培養(yǎng) TIL 產(chǎn)生的 IFN-γ蚤氏，Ilo組（G5,6）的IFN-γ濃度傾向于低于Ihi組（G7,8），但這種差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3N）啼染。
????????總之叔壤，TIL 的數(shù)量有限和可能耗盡以及腫瘤 MHC I 類表達(dá)降低可能會(huì)限制Thi/Ilo G5 和 G6 組針對(duì)新抗原的免疫選擇茂翔。Thi/Ilo/Shi G5 組中最低的免疫反應(yīng)可能歸因于額外的免疫抑制機(jī)制驰吓。
4.TCGA隊(duì)列中肺癌的TIME評(píng)分及其與生存率的關(guān)系
????????接下來涧尿，作者研究了TIME評(píng)分對(duì)預(yù)后的影響。利用TCGA隊(duì)列檬贰，從990例肺癌患者中獲得長(zhǎng)期隨訪數(shù)據(jù)，而不考慮一些臨床特征如組織學(xué)的差異缺亮。進(jìn)行了與ACC隊(duì)列相同的分析（圖S4）翁涤。
????????如圖4A所示，OS表明T-scores萌踱、I-scores和S-scores是重要的預(yù)后因素葵礼。此外，根據(jù)年齡并鸵、性別鸳粉、病理分期和組織學(xué)調(diào)整的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型表明Thi和Shi是獨(dú)立的不利預(yù)后因素，Ihi是獨(dú)立的有利預(yù)后因素（Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型园担，圖4B ）届谈。八組患者的OS明顯不同（圖4C）枯夜，其中Thi/Ilo/Shi G5組預(yù)后最差，而Tlo/Ihi/Slo（G4）組預(yù)后最好艰山。由于Tlo（G1-4）和Thi（G5-8）之間的免疫壓力水平不同湖雹，接下來進(jìn)行亞組分析，發(fā)現(xiàn)所有Tlo組之間的OS相似曙搬。然而摔吏，Thi組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（圖4D）主要是由于S評(píng)分而非I評(píng)分（圖S11）。因此纵装，與G6（Thi/Ilo/Slo）或G8（Thi/Ihi/Slo）相比征讲，G5（Thi/Ilo/Shi）患者的預(yù)后較差（分別為p=0.005和p=0.035），但與G7（Thi/Ihi/Shi）患者的預(yù)后較差（p=0.22）橡娄。這些結(jié)果表明稳诚，免疫抑制更可能影響所有Thi組（G5-8）患者的預(yù)后。
????????最后瀑踢，作者將TIME評(píng)分與之前報(bào)道的其他預(yù)后評(píng)分或因素進(jìn)行了比較扳还。TIME評(píng)分OS預(yù)測(cè)的受試者-操作者特征（ROC）優(yōu)于CYT、TIS（腫瘤炎癥評(píng)分）橱夭、微環(huán)境評(píng)分（xCell）或免疫核心評(píng)分（xCell）氨距，但與傳統(tǒng)TNM分類相當(dāng)，但并不優(yōu)于傳統(tǒng)TNM分類（圖4E）棘劣。
5.肺癌的致癌信號(hào)通路俏让、TIME評(píng)分和預(yù)后
????????眾所周知，腫瘤發(fā)生的共同驅(qū)動(dòng)因素調(diào)節(jié)腫瘤免疫環(huán)境首昔。因此，作者根據(jù)Sanchez-Vega的方法評(píng)估了致癌信號(hào)通路的改變勒奇，并研究了與肺癌T-scores、I-scores和s-scores的相關(guān)性赊颠。如圖5A所示，與Tlo組相比竣蹦，Thi組（p53、RTK-RAS和PI3K）中與致癌信號(hào)通路有關(guān)的基因突變率更高痘括；相比之下，Ilo組的突變率更高（p53滔吠、RTK-RAS纲菌、PI3K和WNT）挠日；S評(píng)分的高低沒有差異。因此驰后，在有這些改變的組中肆资，T-scores顯著較高，I-scores顯著較低（圖5B）灶芝。同時(shí)作者還研究了通路改變對(duì)肺癌患者預(yù)后的影響郑原，僅PIK3通路改變的腫瘤患者預(yù)后不良（圖5C）。這些結(jié)果表明夜涕，PI3K通路的改變與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)犯犁，與較高的T-scores和較低的I-scores一致。
6.TIME分?jǐn)?shù)預(yù)測(cè)ICI反應(yīng)的可能性
? ? ? ? 作者試圖測(cè)試TIME評(píng)分是否能預(yù)測(cè)ICI的反應(yīng)酸役，但沒有合適的ICI治療肺癌患者隊(duì)列。但是不同癌癥的TIME評(píng)分顯示肺癌和黑色素瘤具有相似的T-scores驾胆、I-scores和S-scores以及基于此的類似預(yù)后涣澡，因此利用了76名接受ICI治療的黑色素瘤患者的數(shù)據(jù)集（GSE78220，GSE91061）丧诺。76例病例的熱圖如圖6A所示入桂。雖然Thi/Ilo/Shi組（G5）的疾病控制率往往低于G4、G6或G7組（圖6C）驳阎，但OS組之間沒有顯著差異（圖6B）抗愁。
????????最后，研究了TIME評(píng)分是否能預(yù)測(cè)客觀反應(yīng)率（ORRs）呵晚，生成了TIME評(píng)分的ROC曲線蜘腌。結(jié)果TIME評(píng)分的曲線下面積（AUC）往往高于TIS或CD274表達(dá)（圖6D）。兩組的Kaplan-Meier生存曲線（使用ORR預(yù)測(cè)性的最佳截止水平的高分與低分）顯示饵隙，TIME高分組的患者生存率更高撮珠，但TIS或PD-L1表達(dá)沒有信息（圖6E）。
四癞季、結(jié)論
????????作者基于與肺癌預(yù)后相關(guān)的TIME因素開發(fā)了一種新的評(píng)估模型劫瞳。TIME評(píng)分可以獲取腫瘤增殖，抗腫瘤免疫和免疫抑制之間的復(fù)雜相互作用绷柒，同時(shí)由于本研究中使用的大量WES和RNA-seq數(shù)據(jù)可以從小型活檢樣本中生成，因此該評(píng)分系統(tǒng)可能有助于評(píng)估個(gè)體患者和腫瘤時(shí)間的縱向變化涮因，以進(jìn)一步預(yù)測(cè)肺癌患者的預(yù)后或選擇治療策略废睦。
