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基因talks [e藥安全](javascript:void(0);) 9月28日
ctDNA（circulating tumor DNA） 是腫瘤細胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的 DNA，是循環(huán)游離 DNA（circulating free DNA粒督，cfDNA）或細胞游離DNA（cell free DNA，cfDNA）的一部分蜻展。ctDNA檢測（液體活檢）相對于常規(guī)傳統(tǒng)侵入式實體組織活檢具有非侵入性，患者依從性好惧所，異質(zhì)性低，可反復取材等優(yōu)勢。
▲ 液體活檢 vs 組織活檢
臨床上寄锐，由于ctDNA的半衰期短、濃度及含量低等原因，所以ctDNA檢測需要高靈敏度的技術(shù)橄仆。目前剩膘，實驗室常見的ctDNA檢測技術(shù)有：
? 擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR（ARMS-PCR）；
? 核酸質(zhì)譜（MassARRAY）盆顾；
? 液滴數(shù)字PCR（ddPCR）怠褐；
? 二代測序（NGS）等。1
*（文末有彩蛋）
2019年6月10日發(fā)表于癌癥雜志上的一篇研究您宪，對比了分析了肺腺癌患者血漿ctDNA的兩種EGFR檢測方法：ARMS-PCR vs SABER/MassARRAY （Cancers (Basel), 2019, 11(6): 803. IF=6.162）奈懒。結(jié)果顯示：
? ARMS-PCR vs SABER/MassARRAY檢測血漿ctDNA中EGFR突變的總體靈敏度和特異性分別為：49.1% vs 56%，90% vs 95%蚕涤。兩種方法之間的一致性水平非常高，kappa值為 0.88（95％CI 0.77-0.99）铣猩。
? 一線EGFR-TKI治療后血漿ctDNA中EGFR突變的存在與預后不良有關(guān)（PFS：9.0個月 vs 15.0個月揖铜；OS：30.6個月 vs 55.6個月），可見ctDNA適合作為腫瘤實時療效監(jiān)測及腫瘤進展及不良預后早期預警指標达皿。2
▲ 肺腺癌患者血漿ctDNA兩種EGFR檢測方法對比（IF=6.162）
1關(guān)鍵詞基礎(chǔ)介紹
? EGFR與肺癌診療的關(guān)系：表皮生長因子受體（EGFR）通路在各種實體瘤（包括NSCLC）的生長天吓，增殖和存活中起重要作用，因此峦椰，EGFR是肺癌治療的重要潛在靶標龄寞。
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? ARMS-PCR：擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR （Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR）汤功，又稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR物邑，AS-PCR）。
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? SABER/MassARRAY：****單等位****基因堿基延伸反應結(jié)合質(zhì)譜分析（single allele base extension reaction combined with mass spectroscopy滔金，SABER/MassARRAY）色解。
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2研究流程及結(jié)果
? 研究流程：在本前瞻性研究中，研究者們使用肺腺癌患者的組織樣本確定EGFR突變狀態(tài)餐茵，并比較了ARMS和SABER/MassARRAY方法檢測從這些患者血漿中分離的ctDNA中EGFR突變的效率科阎。同時，還評估了接受一線EGFR-TKI治療的肺腺癌患者的EGFR狀態(tài)與臨床結(jié)果之間的關(guān)系忿族。
▲ 研究流程圖
? 研究樣本數(shù)：2013年2月~2017年3月锣笨，77名肺腺癌患者（57名患者和20名沒有EGFR突變者）。
? EGFR檢測內(nèi)容：包括19del道批、L858R及T790M等错英。
? ARMS檢測試劑：therascreen EGFR RGQ PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany) ，可以檢測組織和血漿ctDNA隆豹。該試劑盒已在美國以及歐洲和亞洲國家獲得批準走趋，用于高靈敏度和特異性的檢測肺癌組織/血漿ctDNA中的EGFR突變。3
? MassARRAY檢測試劑：OncoFOCUS? Panel v1.0（Agena Bioscience，San Diego簿煌，SABER / MassARRAY）氮唯。MassARRAY系統(tǒng)是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間（MALDI-TOF）的中通量多重超靈敏突變檢測系統(tǒng)，可檢測實體瘤患者血漿ctDNA突變姨伟。4
? 組織DNA抽提：使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（Qiagen）試劑盒從5um厚的FFPET中提取DNA惩琉。
? 血漿ctDNA抽提****：使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen）試劑盒從EDTA管采集的1ml血漿中提取ctDNA。
? 研究結(jié)果：
首先使用ARMS方法確定77名肺腺癌患者組織樣本EGFR突變狀態(tài)：57名患者EGFR突變夺荒，20名患者EGFR野生型瞒渠。然后，使用ARMS和SABER/MassARRAY方法分別檢測從77和70名患者血漿中分離的ctDNA中EGFR突變狀態(tài)技扼，并評估接受一線EGFR-TKI治療的肺腺癌患者的EGFR狀態(tài)與臨床結(jié)果之間的關(guān)系伍玖。
① EGFR的檢測：以肺腺癌患者組織樣本的EGFR突變狀態(tài)為標準，ARMS和SABER/MassARRAY檢測血漿ctDNA中EGFR突變的總體靈敏度剿吻、特異性及陽性預測值（PPV）分別為：49.1% vs 56%窍箍，90%vs 95%，93.3% vs 96.6%丽旅。
▲ 兩種方法檢測EGFR對比
②** 19del的檢測：ARMS和SABER/MassARRAY檢測血漿ctDNA中EGFR 19del突變的總體靈敏度椰棘、特異性及陽性預測值（PPV）分別為：50％ vs 53.8％，95.6％ vs 97.7％榄笙，88.9％ vs 93.3％邪狞。**
▲ 兩種方法檢測EGFR 19del對比
③** L858R的檢測：ARMS和SABER/MassARRAY檢測血漿ctDNA中EGFR L858R突變的總體靈敏度、特異性及陽性預測值（PPV）分別為：45％ vs 47.4％茅撞，100％ vs 100％帆卓，100％ vs 100％。**
▲ 兩種方法檢測EGFR L858R對比
④ T790M的檢測：在一名患者的血漿ctDNA中檢測到與EGFR-TKI耐藥相關(guān)的T790M突變米丘，而在EGFR-TKI治療失敗的5名患者的再活檢樣本中也檢測到T790M突變鳞疲。ARMS和SABER/MassARRAY檢測血漿ctDNA中EGFR T790M突變的總體靈敏度、特異性及陽性預測值（PPV）分別為：33.3％ vs 50％蠕蚜，100％ vs 100％尚洽，100％ vs 100％。
▲ 兩種方法檢測EGFR T790M對比
⑤ EGFR突變與預后關(guān)系：參加研究的77名患者中靶累，43例組織檢測到常見EGFR激活突變（L858R和19del）并接受一線EGFR-TKI治療腺毫，在這43例患者中，血漿ctDNA 中EGFR突變的存在與預后不良有關(guān)（PFS：9.0個月 vs 15.0個月挣柬；OS：30.6個月 vs 55.6個月****）潮酒，可見ctDNA適合作為實時療效監(jiān)測及腫瘤進展及不良預后早期預警指標。
▲ EGFR-TKI治療后邪蛔，血漿EGFR突變存在與預后PFS及OS有關(guān)
43例患者中急黎，在預后評估方面，34例ARMS患者和30例SABER/MassARRAY患者在檢測血漿ctDNA EGFR突變時，使用胸部 CT 檢測腫瘤的大小勃教，發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI治療后血漿EGFR突變存在的患者腫瘤較EGFR野生型的患者腫瘤更大淤击。
▲ EGFR-TKI治療后血漿EGFR突變存在的患者腫瘤更大
3研究討論及結(jié)論
討論：
① 本次研究的 ARMS 靈敏度（49.1%）較先前報道的略低（43.1~85.7%）5,6,7，可能原因是研究設(shè)計的問題：血液樣本是在EGFR-TKI治療后采集的故源。事實上污抬，之前的一項研究報道，化療或EGFR-TKI治療后绳军，肺癌患者血漿ctDNA 中EGFR突變的檢出率較低印机。8
② SABRE/MassARRAY是檢測EGFR 19del 和 L858R 突變可靠且靈敏的方法。SABER/MassARRAY的靈敏度略高于ARMS（56％ vs 49.1％）门驾，其中19del的靈敏度（53.8％ vs 50％）射赛，L858R的靈敏度（47.4％ vs 45％），T790M的靈敏度（50％ vs 33.3％）均略高于ARMS奶是，可能與其ctDNA突變檢測下限有關(guān)（SABRE/MassARRAY為0.1％楣责，ARMS為1％）。9 （需要注意的是：Agena官方顯示本研究中使用的 MassARRAY OncoFOCUS? Panel v1.0 是較早的panel诫隅，是用 iPLEX Pro 試劑做的腐魂，官方靈敏度為 5%帐偎；組織 iPLEX HS 是 1%靈敏度逐纬，血液 UltraSEEK 是 0.1%靈敏度。所以實際對比的應該是 5%靈敏度的MassARRAY vs 1%靈敏度的ARMS）
結(jié)論：
此項研究表明削樊，使用ARMS或SABER/MassARRAY方法檢測血漿ctDNA中EGFR突變是有前景豁生，微創(chuàng)和可靠的，是腫瘤組織活檢替代方法漫贞。此外甸箱，研究數(shù)據(jù)表明，作為治療隨訪的一部分迅脐，監(jiān)測血漿ctDNA中EGFR突變狀態(tài)可用作攜帶常見EGFR激活突變和接受一線EGFR-TKI治療的肺腺癌患者的預后標志物芍殖。
前面我們說了，目前谴蔑，實驗室常見的ctDNA檢測技術(shù)有：
? 擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR（ARMS-PCR）豌骏；
? 核酸質(zhì)譜（MassARRAY）；
? 液滴數(shù)字PCR（ddPCR）隐锭；
? 二代測序（NGS）等窃躲。
那么，這四種ctDNA檢測技術(shù)平臺钦睡，有什么區(qū)別呢蒂窒？下面我們從產(chǎn)品供應商，技術(shù)，突變報道情況洒琢，靈敏度秧秉，檢測周期，優(yōu)勢和缺點角度看看纬凤。
MassARRAY UltraSEEKTM
聽說福贞，MassARRAY推出了新的液體活檢技術(shù)：****UltraSEEKTM，靈敏度≥0.1%停士，一起來了解下：
① MassARRAY系統(tǒng)是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間（MALDI-TOF）的中通量多重超靈敏突變檢測系統(tǒng)挖帘。MALDI-TOF質(zhì)譜檢測原理：
② MassARRAY系統(tǒng)有自動化和半自動化工作流程：
③ MassARRAY UltraSEEKTM 檢測原理：Agena核酸質(zhì)譜技術(shù)，不需要在檢測覆蓋度與靈敏度之間進行平衡恋技，在UltraSEEK試劑的幫助下可實現(xiàn)低至0.1%的最小等位基因頻率（MAF）的檢測拇舀。為了獲得高靈敏度，UltraSEEK利用的是多重PCR蜻底，并結(jié)合后續(xù)的突變特異性單堿基延伸和帶有鏈霉親和素標記的磁珠進行捕獲骄崩，內(nèi)置的對照可用于驗證反應中是否存在DNA模板。
參考資料：
1.《液體活檢在臨床腫瘤診療應用和醫(yī)學檢驗實踐中的專家共識 》
2.Hung M S, Lung Jr H, Lin Y C, et al. Comparative Analysis of Two Methods for the Detection of EGFR Mutations in Plasma Circulating Tumor DNA from Lung Adenocarcinoma Patients[J]. Cancers, 2019, 11(6): 803.
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4.Mehrotra, M.; Singh, R.R.; Loghavi, S.; Duose, D.Y.; Barkoh, B.A.; Behrens, C.; Patel, K.P.; Routbort, M.J.; Kopetz, S.; Broaddus, R.R.; et al. Detection of somatic mutations in cell-free DNA in plasma and correlation with overall survival in patients with solid tumors. Oncotarget 2018, 9, 10259–10271.
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9.Ellison, G.; Donald, E.; McWalter, G.; Knight, L.; Fletcher, L.; Sherwood, J.; Cantarini, M.; Orr, M.; Speake,G. A comparison of ARMS and DNA sequencing for mutation analysis in clinical biopsy samples. J. Exp.Clin. Cancer Res. 2010, 29, 132.
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