腫瘤來(lái)源的維甲酸調(diào)節(jié)瘤內(nèi)單核細(xì)胞的分化以促進(jìn)免疫抑制

文獻(xiàn)概述

研究背景介紹

在腫瘤免疫中刃唐，抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells ，APCs)通過(guò)捕獲腫瘤抗原，對(duì)抗原進(jìn)行加工處理崔列，以抗原肽-MHC復(fù)合物的形式提呈給T 細(xì)胞使其活化摧莽，活化的腫瘤特異性抗原的效應(yīng)T細(xì)胞通過(guò)血管遷移并浸潤(rùn)到腫瘤組織中來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，從而產(chǎn)生新的抗原再次被APCs捕獲陨界，如此循環(huán)往復(fù)（immunity巡揍，2013；39, 1–10）菌瘪。其中腮敌，樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）和刺激性腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages俏扩，TAMs）主要促進(jìn)T細(xì)胞的抗腫瘤功能缀皱，而免疫抑制性腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞主要抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展动猬。然而啤斗，有研究表明腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）能夠促進(jìn)抑制性TAMs的產(chǎn)生而抑制DCs的功能赁咙，從而阻礙功能性抗腫瘤T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持钮莲。因此免钻，確定APCs在TME中的分化機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)新的腫瘤免疫治療方法尤為重要。
巨噬細(xì)胞主要是由胚胎前體細(xì)胞或循環(huán)單核細(xì)胞分化而成崔拥。DC來(lái)源于多能造血干細(xì)胞极舔，主要分為髓系DC和淋巴系DC。在髓系DC中链瓦，髓樣干細(xì)胞分化而來(lái)的DC稱為經(jīng)典DC（conventional DCs拆魏，cDC），而循環(huán)單核細(xì)胞分化而來(lái)的DC成為單核細(xì)胞來(lái)源的DC（monocyte-derived DCs慈俯，moDCs）渤刃。DCs作為激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫的最重要的APC，能夠加工與處理腫瘤相關(guān)抗原及腫瘤特異性抗原贴膘，激發(fā)強(qiáng)大而持久的腫瘤抗原特異性的CD4+及CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)卖子。但是moDCs在抗腫瘤過(guò)程中作用尚不清楚。在實(shí)體瘤中刑峡，TME中單核細(xì)胞更傾向分化為抑制性TAMs洋闽，這種偏倚性還需要進(jìn)一步研究。
維甲酸(retinoic acid突梦，RA)是由維生素a衍生物視黃醇通過(guò)一系列酶催化生成的诫舅，其中視黃醇脫氫酶（retinaldehyde dehydrogenases，Raldh）作為RA生成的限速酶能夠催化視黃醇變成RA宫患。許多研究表明RA可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡骚勘，提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，臨床上常用來(lái)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病撮奏。RA也在免疫耐受中發(fā)揮重要作用俏讹，一些研究認(rèn)為RA能夠促進(jìn)DC分化，但也有些研究表明RA可以誘導(dǎo)Foxp3+Treg和Arg+的抑炎性巨噬細(xì)胞畜吊。還有報(bào)道稱RA能夠促進(jìn)Th1或Th17細(xì)胞應(yīng)答泽疆，阻礙髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞的功能。不同的實(shí)驗(yàn)因素導(dǎo)致了這些矛盾的結(jié)果玲献。由于TME中細(xì)胞組成的復(fù)雜性殉疼，RA在其中扮演什么角色呢？
賓夕法尼亞大學(xué)Malay Haldar課題組在本研究中打破了RA作為抗腫瘤劑這一范式捌年，他們利用肉瘤模型發(fā)現(xiàn)TME中的IL-13能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生RA瓢娜，RA通過(guò)抑制促進(jìn)DC分化的轉(zhuǎn)錄因子IRF4的表達(dá)使腫瘤內(nèi)單核細(xì)胞向抑制性TAMs分化，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展礼预。

主要發(fā)現(xiàn)

1. 腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生RA眠砾。
2. RA使單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞而不是向DC分化。
3. 阻斷RA的產(chǎn)生可增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞免疫力托酸。
4. 藥理阻斷RA信號(hào)可以增強(qiáng)抗PD-1療法的效果褒颈。

專家點(diǎn)評(píng)

邏輯亮點(diǎn)：作者從肉瘤模型中TAMs比例明顯高于DCs這一有趣的現(xiàn)象出發(fā)柒巫，利用遺傳譜系示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)TME能夠促進(jìn)單核細(xì)胞向抑制性TAMs極化；通過(guò)TAMs的基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)谷丸，TAMs表達(dá)高水平的維甲酸結(jié)合蛋白（retinoic acid binding proteins堡掏，CRABPs），而TME中確實(shí)有大量的RA刨疼，并且這些RA主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞泉唁。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RA可以調(diào)控瘤內(nèi)單核細(xì)胞的分化方向揩慕，使其分化為抑制性TAMs亭畜，而抑制其向DCs的分化。當(dāng)減少RA的產(chǎn)生或者阻斷RA-RAR信號(hào)軸時(shí)漩绵，TME中APCs產(chǎn)生更多的免疫刺激性分子贱案，提高了T細(xì)胞的抗腫瘤應(yīng)答和抗PD-1療法治療腫瘤的效果肛炮。
由于RA常用來(lái)預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)止吐，這一新的發(fā)現(xiàn)打破了RA作為一種抗腫瘤劑的固有認(rèn)識(shí)，也為部分患者用藥后效果不佳提供了新的理論解釋侨糟。本篇研究也進(jìn)一步為T(mén)ME中APCs的分化和腫瘤免疫抑制環(huán)境的塑造提供了新的見(jiàn)解碍扔，為腫瘤免疫治療提供一個(gè)新的臨床思路。

可借鑒之處

這篇研究雖然思路比較簡(jiǎn)單秕重，作者論證的方法卻十分巧妙不同。研究腫瘤微環(huán)境中單核細(xì)胞的極化方向時(shí)，作者用遺傳譜系示蹤技術(shù)標(biāo)記單核細(xì)胞（tdTom）和樹(shù)突狀細(xì)胞（GFP）溶耘，將帶有熒光標(biāo)記的單核細(xì)胞分離出來(lái)之后回輸?shù)胶闪鲂∈篌w內(nèi)二拐，從腫瘤中分離出來(lái)tdTom陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)一步分析其分化方向，有力證明了腫瘤微環(huán)境中單核細(xì)胞更傾向分化為抑制性TAMs凳兵；在證明TME能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生RA時(shí)百新，作者將分泌RA的Aldh+腫瘤細(xì)胞和不分泌Aldh-腫瘤細(xì)胞從腫瘤中分離出來(lái)，發(fā)現(xiàn)Aldh+腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)并不能分泌RA庐扫，而將Aldh-腫瘤細(xì)胞接種到小鼠身上饭望，發(fā)現(xiàn)Aldh-腫瘤細(xì)胞也能夠分泌RA。最后作者從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中病人的樣本中進(jìn)一步論證了RA和抑制性免疫微環(huán)境的相關(guān)性形庭，提升了這項(xiàng)研究的臨床意義铅辞。這些都非常值借鑒。萨醒，

進(jìn)一步研究的問(wèn)題

RA能夠抑制IRF4的表達(dá)來(lái)抑制單核細(xì)胞向DC的分化斟珊，那么RA促進(jìn)TAMs分化的具體機(jī)制又是什么呢？是否能夠利用這些機(jī)制發(fā)展出更好的方法來(lái)靶向抑制TAMs分化呢富纸？

值得探討的問(wèn)題

既然瘤內(nèi)T細(xì)胞分泌的IL-13能夠作用于腫瘤細(xì)胞倍宾，促進(jìn)RA的產(chǎn)生雏节，而RA又能夠促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，那么作者為什么不使用抗IL-13的抗體看看能否減緩腫瘤進(jìn)展呢高职？

圖片解析

腫瘤微環(huán)境中單核細(xì)胞的分化情況钩乍？

在肉瘤模型發(fā)現(xiàn)TME中，單核細(xì)胞（CD45+CD11b+Ly6C+）和TAMs（CD45+CD11b+F4/80+Ly6C-）占據(jù)了白細(xì)胞的大多數(shù)(A)怔锌，而DCs（CD45+ZBTB46+）卻很少(B)寥粹。將這三種細(xì)胞分離出來(lái)，體外和T細(xì)胞共孵育發(fā)現(xiàn)埃元，TAMs極大地抑制了T細(xì)胞增殖（C涝涤，D），而DCs能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖（E）岛杀。利用譜系示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)單核細(xì)胞向TAMs方向分化(F阔拳，G，H)类嗤。體外分離TME中的單核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)這些單核細(xì)胞也能分化成DC (I糊肠，J)，所以猜測(cè)是腫瘤微環(huán)境中的某些因素抑制瘤內(nèi)單核細(xì)胞向DCs分化遗锣，促進(jìn)其向TAMs分化货裹。

Figure1

結(jié)論1：TME能夠促進(jìn)單核細(xì)胞向抑制性TAMs分化。

哪些因素驅(qū)動(dòng)瘤內(nèi)單核細(xì)胞向TAMs分化呢精偿？

通過(guò)分析TAMs的基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)弧圆，TAMs細(xì)胞表達(dá)更高的視黃酸結(jié)合蛋白（ CRABPs） （A），腫瘤組織也有更高的Raldh表達(dá)（B）笔咽。然后搔预，用液相色譜/質(zhì)譜檢測(cè)肉瘤模型中RA的主要生物活性亞型反式維甲酸（ATRA）含量均高于正常間質(zhì)組織(C)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)叶组，RA主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞（D）拯田，而且不同的肉瘤類型Raldh的三種亞型表達(dá)水平也不一樣（E）。但在體外培養(yǎng)時(shí)扶叉，腫瘤細(xì)胞系幾乎不表達(dá)Raldh勿锅，而在腫瘤組織卻高表達(dá)（F）。所以猜測(cè)TME中某些因素導(dǎo)致RA的分泌枣氧。為了證實(shí)這一猜想溢十，將腫瘤組織中 Aldh+的腫瘤細(xì)胞（即表達(dá)Raldh的腫瘤細(xì)胞）和Aldh-的腫瘤細(xì)胞（即不表達(dá)Raldh的細(xì)胞）分離出來(lái)體外培養(yǎng)一段時(shí)間（G），發(fā)現(xiàn)表達(dá)Raldh的腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)停止了RA的產(chǎn)生（H）达吞，當(dāng)把這兩種細(xì)胞重新接種到小鼠身上（G）张弛，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)兩種細(xì)胞株表達(dá)的Aldh并沒(méi)有差別（I）。那么究竟TME中什么因素誘導(dǎo)Aldh的表達(dá)呢？通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)表達(dá)Aldh的腫瘤細(xì)胞表達(dá)更高的IL13Rα2 (J)吞鸭。由于IL13Rα2能夠被IL-13信號(hào)誘導(dǎo)表達(dá)寺董，體外用IL-13刺激肉瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Raldh 3表達(dá)明顯升高(K)刻剥。當(dāng)敲除IL13Rα1時(shí)遮咖，IL-13刺激并不能上調(diào)IL13Rα2和Raldh3的表達(dá)（L）。移植敲除IL13Rα1的腫瘤細(xì)胞株成瘤后也發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中Raldh3的表達(dá)下降（M）造虏。

Figure2

結(jié)論2：TME中IL-13能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生更多的RA御吞。

腫瘤微環(huán)境中的RA是怎么影響單核細(xì)胞分化的？

體外培養(yǎng)條件下漓藕，RA能夠抑制單核細(xì)胞向DC分化(A,B)陶珠，促進(jìn)單核細(xì)胞向TAMs分化(D，E)享钞。使用RAR的激動(dòng)劑CH55也能夠抑制DCs的分化揍诽，其拮抗劑BMS493能夠抵消RA的作用（C）。RA對(duì)腫瘤來(lái)源的單核細(xì)胞也有同樣的作用（F栗竖，G）暑脆。有趣的是，在RA刺激下划滋，單核細(xì)胞來(lái)源的APCs和TAMs抑制功能也隨之增強(qiáng)（H饵筑，I埃篓，J）处坪。微陣列基因表達(dá)譜分析，RA處理細(xì)胞后架专，和巨噬細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)同窘，而和DC分化相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)(K，L)部脚。因?yàn)镽A能夠下調(diào)IRF4的表達(dá)想邦，之前有研究表明，單核細(xì)胞向DCs分化需要IRF4參與委刘，所以RA可能通過(guò)抑制IRF4的表達(dá)進(jìn)而抑制單核細(xì)胞向DCs分化丧没。通過(guò)使用RA的激動(dòng)劑CH55或抑制劑BMS493，證實(shí)了這一猜想（M锡移，N）呕童。與RA刺激野生型小鼠來(lái)源的APCs作用類似，當(dāng)IRF4敲除后淆珊，T細(xì)胞的增殖也受到抑制（O）夺饲。過(guò)表達(dá)IRF4后，RA抑制DCs分化的作用也隨之消失（P）。

Figure3

結(jié)論3：RA在體外能夠促進(jìn)單核細(xì)胞向抑制性TAMs分化往声，抑制其向DCs分化擂找。

RA能夠影響DCs的分化，阻斷RA分泌或其信號(hào)通路對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞有什么影響浩销？

由于Raldh3敲除后贯涎，Raldh1表達(dá)水平會(huì)代償性增加，所以作者構(gòu)建了Raldh1/3雙敲除的小鼠（DKO）阻斷RA的分泌慢洋。與對(duì)照組相比柬采，DKO小鼠瘤內(nèi)TAMs比例明顯下降（A），而CD11b+ DC的比例明顯上升（B）且警。在DKO小鼠瘤內(nèi)相當(dāng)一部分F4/80+ TAMs表達(dá)CD11c和MHCII分子粉捻。為了進(jìn)一步明確RA引起腫瘤內(nèi)白細(xì)胞的變化，用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)比較了DKO荷瘤鼠和正常荷瘤鼠腫瘤浸潤(rùn)的CD45+細(xì)胞發(fā)現(xiàn)（D）斑芜，瘤內(nèi)髓系來(lái)源的細(xì)胞具有較大差異肩刃，DKO小鼠瘤內(nèi)髓系來(lái)源的細(xì)胞具有高比例的DCs（E，F(xiàn)）杏头。進(jìn)一步分析TAM發(fā)現(xiàn)盈包，DKO小鼠瘤內(nèi)TAM表達(dá)更少的免疫抑制性分子（TAM1），更多的免疫刺激性分子（TAM2）（F醇王，G）呢燥。當(dāng)DKO荷瘤鼠來(lái)源的TAMs和T細(xì)胞共孵育發(fā)現(xiàn)，TAMs抑制T細(xì)胞增殖的能力明顯下降（H）寓娩。但血液中白細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例并沒(méi)有明顯變化叛氨，說(shuō)明減少腫瘤細(xì)胞分泌RA對(duì)免疫應(yīng)答的影響局限于免疫微環(huán)境（I）。分析TIL發(fā)現(xiàn)棘伴，DKO荷瘤鼠TIL中CD4+T細(xì)胞比例明顯上升(J)寞埠，T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力也明顯提高（K)。

Figure4

結(jié)論4：減少腫瘤細(xì)胞分泌RA能夠增強(qiáng)瘤內(nèi)刺激性APCs的產(chǎn)生

既然RA能夠影響免疫應(yīng)答焊夸，那么減少RA分泌能增強(qiáng)抗腫瘤效果嗎仁连？

與對(duì)照組相比，DKO荷瘤鼠腫瘤體積明顯減小阱穗，生存期明顯延長(zhǎng)(A饭冬，B)。當(dāng)在DKO腫瘤細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)Raldh2修復(fù)RA的產(chǎn)生時(shí)揪阶，腫瘤生長(zhǎng)恢復(fù)對(duì)照組水平（C）昌抠，而且瘤內(nèi)髓系來(lái)源的細(xì)胞表達(dá)更多的刺激性分子（D）。剔除CD4+或CD8+T細(xì)胞后遣钳，腫瘤快速生長(zhǎng)扰魂，也進(jìn)一步證明了T細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中的作用（E）麦乞。在Batf3-/ -小鼠中（cDC1s缺失），DKO腫瘤也迅速增長(zhǎng)劝评，證明了RA減少所引起的抗腫瘤效應(yīng)需要cDC1s的參與（F）姐直。當(dāng)接種過(guò)表達(dá)OVA肽段的DKO腫瘤細(xì)胞株時(shí)，荷瘤鼠脾臟中腫瘤特異性的CD8+ T細(xì)胞的比例也明顯上升（G）蒋畜。如果同時(shí)給予免疫檢查點(diǎn)PD-1阻抗劑則顯示出明顯的抗腫瘤協(xié)同作用(H声畏，I)，并且聯(lián)合治療組中完全消退的小鼠能夠持續(xù)抵抗該細(xì)胞株姻成，而對(duì)其他腫瘤細(xì)胞株沒(méi)有抵抗作用（J）插龄。當(dāng)在正常C57小鼠一側(cè)注射DKO腫瘤細(xì)胞株一側(cè)注射正常對(duì)照腫瘤細(xì)胞株時(shí)發(fā)現(xiàn)，RA分泌的減少也能提高對(duì)側(cè)腫瘤對(duì)抗PD-l治療的敏感性（K科展，L均牢，M）。

Figure5

結(jié)論：減少腫瘤分泌的RA能夠提高T細(xì)胞的抗腫瘤應(yīng)答才睹，并且增強(qiáng)抗PD-1療法的效果徘跪。

體內(nèi)阻斷RAR信號(hào)對(duì)腫瘤免疫應(yīng)答的影響是否和阻斷RA產(chǎn)生的效果一致呢？

當(dāng)用藥物BMS493阻斷RA-RAR這個(gè)信號(hào)軸的時(shí)候琅攘，荷瘤小鼠瘤內(nèi)TAMs比例明顯降低（A）垮庐，APCs表達(dá)更多的活化型marker（B），T細(xì)胞比例也隨之提高（C）坞琴。有趣的是哨查，在肉瘤模型中BMS493治療也能提高抗PD1療法的效果（E），但是由于B16F10不分泌RA剧辐，該腫瘤模型中BMS493治療并沒(méi)有效果寒亥，也不能提高該腫瘤對(duì)抗PD-1療法的應(yīng)答（F）。在自發(fā)肉瘤模型中浙于，BMS493治療也能提高瘤內(nèi)刺激性髓系來(lái)源的細(xì)胞和T細(xì)胞的比例护盈，并且TAMs表面傾向于高表達(dá)一些免疫刺激性分子（G挟纱，H）羞酗。BMS493刺激LysMCre：Rosa26tdT小鼠來(lái)源的骨髓單核細(xì)胞回輸?shù)酵吹腇S腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組紊服，腫瘤微環(huán)境中回輸?shù)膯魏思?xì)胞很大一部分分化成了CD11c+ MHCII+ DCs（I）檀轨，而且回輸BMS493刺激后的單核細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)明顯減慢（J），TME中有更高比例活化型的APCs和殺傷作用的T細(xì)胞（K）欺嗤。

Figure6

結(jié)論6：體內(nèi)抑制RAR信號(hào)能夠增加TME中刺激性APCs的數(shù)量参萄，并且能夠協(xié)同抗PD-1抗體治療腫瘤。

這一發(fā)現(xiàn)有什么臨床意義煎饼？

首先讹挎，作者評(píng)估臨床上肉瘤病人的樣本，發(fā)現(xiàn)病人的腫瘤組織確實(shí)高表達(dá)RALDH(A)，而且主要是CD45-的細(xì)胞表達(dá)（B筒溃，C）马篮。當(dāng)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的肉瘤病人數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，RA在一些肉瘤亞型中存在富集怜奖，主要包括STLMS浑测、ULMS、SS(D)歪玲。在DDLPS迁央、UPS和MFS中RA富集評(píng)分更高(E)。在多種腫瘤細(xì)胞中滥崩，RA的富集評(píng)分和RALDH3的表達(dá)成正相關(guān)岖圈，一些TGF-β和IL-10信號(hào)通路相關(guān)的免疫抑制分子也和RA的富集分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性（F）。

Figure7

結(jié)論：臨床中钙皮，RA的富集評(píng)分與抑制性腫瘤微環(huán)境成有一定相關(guān)性幅狮。

有啥問(wèn)題的小伙伴歡迎提問(wèn)！不定期更新
原創(chuàng)株灸，首發(fā)于Lab in one公眾號(hào)崇摄。