摘要

新生兒出生后吊履，腸道菌群的定植對新生兒的健康發(fā)育起著至關重要的作用疯趟，并影響其日后的健康和疾病。了解新生兒腸道菌群的發(fā)育以及其與新生兒宿主的相互作用是一個重要的研究領域。然而圾亏，該領域的研究必須解決影響研究方法設計和實施的一系列具體挑戰(zhàn)。如果不加以考慮碗誉，那么這些問題可能會給研究帶來偏倚召嘶，從而對研究結果的相關性、可重復性和效應產生負面影響哮缺。本文概述了這些挑戰(zhàn)的性質弄跌，并提供了當前和未來的解決方案，以幫助研究人員更好地進行研究設計尝苇。

前言

人類腸道寄居著大量的微生物铛只，包括細菌埠胖、真菌、病毒和古菌淳玩，形成了一個高度復雜和多樣化的群落直撤。這種微生物組已被證明在宿主內部的許多生理過程中發(fā)揮著重要作用，包括但不限于：免疫系統(tǒng)的發(fā)育和調節(jié)蜕着、神經信號傳導的改變谋竖、維生素和氨基酸的生物合成、食物消化以及抑制病原體的生長承匣。因此蓖乘，腸道菌群對于人類健康的發(fā)展和維持至關重要。腸道菌群的異常發(fā)展會對宿主的健康產生負面影響韧骗。腸道菌群的紊亂與胃腸道嘉抒、神經系統(tǒng)、代謝袍暴、肝臟些侍、自身免疫、心血管和腫瘤等疾病有關政模。這種在健康和疾病方面的重大影響對新生兒來說尤其如此岗宣，因為在新生兒中，微生物群落淋样、宿主免疫系統(tǒng)和屏障防御機制都在發(fā)展狈定。腸道微生物定植通常從出生時開始，嬰兒從子宮出來時就接觸到活性微生物习蓬。在出生后一年內，腸道菌群對于訓練嬰兒的免疫系統(tǒng)和促進長期健康的生理發(fā)育至關重要措嵌。生命早期腸道菌群的異常發(fā)展與出生后不久出現(xiàn)嚴重的病理狀況有關躲叼，如壞死性小腸結腸炎(NEC)，這是早產兒死亡的主要原因之一企巢。

因此枫慷，了解新生兒腸道微生物群的發(fā)育及其與宿主的相互作用機制，對于維持和改善人類的健康狀況至關重要浪规，這種健康結果可以持續(xù)到兒童期甚至更長時間或听。重要的是，該領域的研究必須解決一系列挑戰(zhàn)笋婿，這些挑戰(zhàn)可大致分為三個方面：

①設計和招募具有代表性的研究隊列誉裆；

②準確檢測腸道微生物組的組成；

③研究新生兒宿主與腸道微生物組之間的相互作用缸濒。

****設計和招募代表性研究隊列****

盡管新生兒腸道菌群的多樣性不如成人足丢，但其仍然是一個部分受遺傳和環(huán)境因素影響的復雜系統(tǒng)粱腻，并且具有不同的特性，這些特性在嬰兒之間存在差異斩跌。因此绍些，研究結果會受到各種協(xié)變量和混雜因素的影響。這些因素包括早產耀鸦、飲食柬批、生活在有毛茸茸寵物的家庭中、使用益生菌袖订、抗生素治療氮帐、居住在農村或城市、特定等位基因頻率著角、種族和父母社會經濟地位等等揪漩。在分析研究數(shù)據(jù)時，還必須考慮到產婦健康因素吏口，因為抗生素的使用奄容、母親的體重指數(shù)、膳食攝入和妊娠期糖尿病的發(fā)生都已被證明會對新生兒微生物組的發(fā)育產生影響产徊。因此昂勒，必須仔細設計研究隊列，以反映感興趣人群中協(xié)變量的平衡舟铜，并盡可能排除混淆因素戈盈。

i）隊列設計

隊列規(guī)模在這方面是一個重要的因素，對于確定試驗的統(tǒng)計功效尤其關鍵谆刨。鑒于分析微生物組數(shù)據(jù)集的方法眾多(如alpha多樣性塘娶、beta多樣性、相對豐度)痊夭，執(zhí)行功效計算并非易事刁岸，而且可能存在一定的主觀性。變量的效應量越小她我，檢測相關信號和克服混淆因素的掩蔽所需的樣本量就越大屠凶。當研究宿主基因對微生物組的影響時尤其如此涌萤。直接測序候選基因組以確定感興趣的等位基因將需要數(shù)百名新生兒的數(shù)據(jù)统扳，而全基因組關聯(lián)研究(GWAS)通常需要數(shù)千人的隊列捍歪。然而，在解決以新生兒微生物組表型和相關病理為重點的研究問題時恨狈，招募足夠多的樣本量可能具有挑戰(zhàn)性疏哗。早產兒NEC的研究就是一個關鍵例子。只有10%的嬰兒是早產兒禾怠，其中大約5-10%患有NEC沃斤。這使得可用于研究的患者數(shù)量有限圣蝎。

當患者數(shù)量有限時，跨整個國家或國際開展多中心研究可以最大化樣本量衡瓶。從多個地理位置招募也可能增加隊列的人口統(tǒng)計學多樣性徘公，使其更具有代表性和普適性。除了觀察性研究之外哮针，將微生物組研究嵌入隨機對照試驗(RCT)中可以探索潛在的機制关面。在英國進行的早產兒腸道影響機制(MAGPIE)研究就是一個例子，該研究招募了來自12家NHS醫(yī)院的479名早產兒十厢。當然等太，大型隊列和多中心研究會使樣本收集的后續(xù)工作變得復雜，需要將樣本存儲并運輸?shù)街行恼军c進行分析蛮放。此外缩抡，更大和更多樣化的隊列可能會引入額外的混淆因素，而這些混淆因素可能在使用較小和更均質的隊列時是不存在的包颁。需要注意的是瞻想，無論隊列的大小或地理分布如何，任何研究結果都僅限于在研究中調查的當?shù)孛浣馈一蛑揠H人口蘑险。特別是考慮到工業(yè)化和非工業(yè)化國家之間的差異時，影響腸道菌群的大量協(xié)變量和混淆因素使結果難以推廣到所有新生兒岳悟。如果這些關聯(lián)背后的生物學機制得到充分研究佃迄，那么由于所有人類在生物學上具有基本的相似性，就有可能超越狹窄群體范圍進行更廣泛的推斷贵少。

ii）控制混淆因素的其他方法

除了優(yōu)化隊列大小和地理分布外呵俏，還有一些方法可以解決微生物組研究中容易受到混淆因素影響的問題。通過基于一組特征對隊列進行限制滔灶，以減少這些特征導致的混雜效應柴信。例如，可以將研究限制在僅包括妊娠37周后出生的新生兒宽气，從而消除早產兒與足月兒這一混淆因素對微生物組的影響。如果是研究某一特定表型或病理學特征潜沦，則可以采用匹配方法萄涯，根據(jù)潛在混淆因素將表型/病理陽性和陰性組進行成對匹配。例如唆鸡，在NEC研究中就使用了這種方法涝影，將NEC和非NEC新生兒的各種特征(包括胎齡、出生體重以及是否接受益生菌等)進行匹配争占。限制和匹配方法燃逻，以及樣本量和地理位置序目，都構成了初始隊列設計的一部分。此外伯襟，在收集完數(shù)據(jù)之后猿涨，還有一些分析方法可以防止混淆因素帶來的影響，如分層分析和多變量分析方法姆怪。

分層分析是將研究隊列根據(jù)潛在混淆因素(例如年齡或性別)劃分為不同層次的過程叛赚。然后可以觀察到特定層次內的關聯(lián)性，這些關聯(lián)性與整個隊列的關聯(lián)性不同稽揭，從而確認某個變量是否是混淆因素俺附。但對于具有大量元數(shù)據(jù)類別的隊列來說，分層可能會過于復雜和耗時溪掀，因為每增加一個變量事镣，需要分析的層數(shù)就會迅速增加。多變量分析方法更適用于這類數(shù)據(jù)集揪胃。通過使用一個綜合的數(shù)學過程璃哟，研究感興趣的變量并調整潛在的混淆變量。此外只嚣，分層可以揭示與特定子層次相關的效應沮稚，這些效應在多變量分析和調整中可能被忽略。分層分析的另一個優(yōu)勢是可以更容易地在子層次中識別交互效應册舞。例如蕴掏，根據(jù)嬰兒是否母乳喂養(yǎng)對數(shù)據(jù)進行分層，可以更清晰地觀察母乳喂養(yǎng)與其他變量之間的交互作用效應调鲸，以及它們對腸道微生物組成的影響盛杰。

****準確檢測腸道微生物組的組成****

準確分析腸道菌群與協(xié)變量的關聯(lián)，取決于對微生物組成的準確檢測藐石。整個研究都以這個過程的穩(wěn)健性和精確性為前提即供。但已有研究表明，實驗設計和方法選擇可能會影響糞便菌群組成并使下游分析產生偏差于微。樣本制備的各個階段都是如此逗嫡，包括樣本收集、樣本儲存株依、DNA提取和測序方法驱证。在討論對基于培養(yǎng)方法的影響之前，本節(jié)將首先重點關注基于分子的方法恋腕，即16S rRNA基因測序和宏基因組學抹锄。對測序方法的詳細討論超出了本綜述的范圍，但研究人員在設計研究時應考慮該技術的最新發(fā)展。例如伙单，較長的讀取長度可以改進基因組組裝和結構變異的檢測获高，而測量絕對豐度可以更準確地反映真實微生物變化的情況。

圖1總結了在這些階段盡量減少引入偏差的方法吻育。

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i）樣本收集

個體腸道菌群的組成會隨時間波動念秧，這意味著在某一天收集的樣本不能被視為其微生物群落的確切代表。研究必須使用縱向采樣來檢測扫沼、分析和說明這種變異出爹。因此，樣本收集的時間是任何微生物組研究中的關鍵因素缎除。這將影響到研究內部以及已經發(fā)表的數(shù)據(jù)集之間的比較严就。研究新生兒對這一過程提出了挑戰(zhàn)，因為無法精確控制新生兒排便的時間器罐，他們無法表達自己的意愿梢为，也無法自己收集樣本。這個過程還受到新生兒是在醫(yī)院還是在家的影響轰坊。在醫(yī)院內铸董，病房工作人員會系統(tǒng)地收集樣本，但是糞便仍然會暴露在尿布內的環(huán)境溫度和氧氣中肴沫，通常暴露的時間不確定粟害。這是一個問題，因為暴露于環(huán)境溫度已被證明會影響嬰兒糞便樣本中不同細菌屬的生長或抑制颤芬。相比之下悲幅，如果新生兒在家中，父母可能很快就知道新生兒是否排便站蝠，然后可以要求父母在收集樣本之前估計樣本在尿布里的存在時間汰具，從而測量樣本暴露于環(huán)境溫度中的時間。

ii）樣本儲存

在樣本收集之后菱魔，需要對其進行處理和分析留荔，如果無法立即進行分析，則應將其儲存起來澜倦。樣本的正確儲存對于穩(wěn)定糞便微生物組至關重要聚蝶，因為有研究表明，如果將其放置在室溫下48小時藻治，糞便微生物組會發(fā)生顯著變化碘勉。這種變化是由于細菌種類的差異性生長和死亡，以及細菌DNA在這種溫度和氧條件下的降解所導致的栋艳。如果樣本在這種條件下保存，將無法準確測量采樣時的體內腸道菌群句各，并且會使后續(xù)分析產生偏差吸占。因此晴叨，樣本儲存對于任何新生兒微生物組研究都是一個關鍵問題。這對于多中心研究或依賴于在家收集患者樣本的研究尤其如此矾屯。對于這類研究兼蕊，樣本可能需要運送到研究機構進行分析，這延長了處理開始前的時間件蚕，如果不考慮適當?shù)牟杉痛鎯l件孙技，那么就會增加微生物群發(fā)生變化的可能性。

已有多項研究對不同儲存方法保存糞便菌群的能力進行了評估排作。最近對92項研究進行的系統(tǒng)回顧發(fā)現(xiàn)牵啦，在這些研究中有71.4%采用了-80℃冷凍的方法，這是最常用的方法妄痪。經證實哈雏，在此溫度下保存新生兒糞便樣本可在很大程度上保留微生物菌群至少2年。此外衫生，由于樣本的快速冷凍和通過冷鏈運輸并非總是可行的裳瘪，因此也對各種儲存緩沖液進行了測試。其中評估最廣泛的是商用OMNIgene.Gut Stool Microbiome Kit (DNA Genotek)罪针。Choo等人發(fā)現(xiàn)彭羹，經過72小時的儲存后，與冷凍-80℃的對照組相比泪酱，微生物群組成或多樣性無明顯差異派殷。相比之下，存儲在RNAlater和Tris-EDTA中的樣本顯示出大量的菌群轉移西篓。

Panek等人發(fā)現(xiàn)OMNIgene.Gut試劑盒中的樣本在室溫下保存14天的效果優(yōu)于冷凍愈腾。他們還指出，與冷凍相比岂津，這種緩沖液可以更好地保存變形菌門虱黄，但可能會人為地增加薩特氏菌屬的存在。另一種保存試劑盒吮成，即糞便核酸收集和保存管(Norgen BioTek Corp)橱乱，也可以根據(jù)細菌細胞壁結構改變特定屬的表征。這些工作主要是為了考察樣本儲存如何影響分子分析粱甫，特別是16S rRNA基因測序和宏基因組測序泳叠，從而最終反映出對細菌DNA的保存情況。同時茶宵，考慮樣本直接培養(yǎng)和分離細菌的情況也很重要危纫。從糞便中培養(yǎng)活微生物可以確定分子方法可能遺漏的細菌。此外，分離微生物還可用于進一步的實驗工作种蝶，包括研究特定菌株的代謝能力或微生物-宿主相互作用契耿。最好的做法是將糞便樣本等量分裝在多種低溫保存培養(yǎng)基中，以保證分離菌株的分類范圍盡可能廣泛螃征。

iii）細菌DNA的提取和純化

在提取DNA之前搪桂，糞便樣本必須完全均質化。研究表明盯滚，對糞便進行分采樣可獲得高度可變的微生物菌群數(shù)據(jù)踢械，這是由于不同菌群被包裹在不同的微環(huán)境中。因此魄藕，均質化有助于減少樣本內變異内列。目前有許多商業(yè)化試劑盒都經過優(yōu)化，可用于從各種樣本類型(包括糞便)中提取DNA泼疑。Westaway等人(2021)對92項早產兒腸道微生物組的系統(tǒng)性回顧反映了這一點德绿，他們發(fā)現(xiàn)提取方法(共有15種不同的方法)的選擇存在很大差異。其中退渗，使用最多的是Qiagen QIAmp DNA糞便試劑盒(占40.3%的研究)移稳，其次是非商業(yè)試劑盒(14.9%)和Qiagen PowerLyzer PowerSoil試劑盒(10.4%)。DNA提取方法的選擇是微生物組分析中的一個重要偏倚來源会油，主要取決于所使用的均質化和裂解方法个粱。細菌的細胞壁結構在這里是一個關鍵因素，因為革蘭氏陽性細胞具有更厚的肽聚糖層翻翩，因此可能需要比革蘭氏陰性細胞更長的裂解時間或更強的裂解力都许。因此，由于裂解不徹底導致細胞壁保持完整嫂冻，或者由于過度強烈的裂解使容易溶解的細胞的DNA降解胶征，那么整個屬可能會在下游分析中被遺漏。

上述偏倚可以通過方法標準化來解決桨仿。使用國際標準化的微生物組分析方案(包括樣本收集和儲存睛低、DNA提取、測序和生物信息學流程)將減少這些階段的混淆因素服傍，并使結果更加一致钱雷。然而，這樣的方案可能不能滿足特定研究團隊的特定需求吹零。另一種方法是開發(fā)一套參考試劑作為國際標準罩抗，以驗證其他方法。生物信息學方法也可以根據(jù)特定方法引入的變異性對數(shù)據(jù)進行歸一化灿椅。

****研究新生兒宿主與腸道菌群之間的相互作用****

對新生兒腸道菌群及其隨時間發(fā)展的描述可以為研究人員提供假設套蒂，并有助于其后續(xù)工作钞支。這些工作包括了解新生兒腸道上皮(即宿主)如何響應和適應細菌的定植。雖然已知宿主-微生物群的相互作用是新生兒健康生理和某些病理發(fā)展的基礎操刀，但這些過程的詳細機制在很大程度上仍是未知的伸辟。解決這些問題的嘗試也因所面臨的倫理考慮而變得困難。

缺乏可用于研究的新生兒腸道組織是研究人員面臨的一個重大阻礙馍刮。在成年人中，通過使用內窺鏡活檢獲取組織進行研究來調查與腸道相關的病理(如腸易激綜合征)窃蹋。然而卡啰，這種方法并不適用于新生兒群體，因此研究人員只能依賴于從手術拯救中切除的新生兒組織(即不是為了研究目的收集警没，而是使用原本會被丟棄的切除組織)匈辱。這種重大手術通常是在患有嚴重疾病的嬰兒身上進行的，這意味著收集的組織通常是不健康的杀迹。這使得研究早產兒和足月兒正常腸道組織的發(fā)育和功能變得更具挑戰(zhàn)性亡脸，同時也使得難以設計適當?shù)膶φ諚l件進行離體實驗。

i）動物模型

使用與人類腸道解剖結構相似的動物模型是這個問題的一個解決方案树酪。目前已經建立了小鼠浅碾、大鼠和豬的早產兒和足月兒腸道模型。使用無菌小鼠续语、大鼠和豬進行的微生物組研究為我們提供了重要見解垂谢，揭示了腸道菌群與免疫成熟、健康的腸道上皮形態(tài)疮茄、骨骼肌生長以及疾病病理之間的關聯(lián)滥朱。然而，這些模型在許多方面仍然存在限制力试，比如動物護理成本高徙邻、缺乏在人類群體中觀察到的遺傳變異、無法完全再現(xiàn)塑造人類腸道微生物組的復雜環(huán)境因素畸裳，盡管存在相似之處缰犁，但解剖和生理方面的差異阻礙了人類系統(tǒng)的真正重建。它們作為早產兒腸道模型也有一定的局限性躯畴，因為早產小鼠民鼓、大鼠和豬大約在妊娠期的90-95％出生，而人類早產兒可能在妊娠期的60％出生蓬抄。因此丰嘉，早產動物可能無法準確地模擬早產人類的免疫系統(tǒng)和解剖結構的不成熟。該模型研究的另一個缺點是這些動物具有不同于人類的內源性腸道微生物組嚷缭。雖然建立了人源化動物腸道菌群的方法饮亏，但目前尚不清楚特定的人類菌群在這些動物腸道中的定植情況耍贾，并且移植的微生物群是否能夠發(fā)揮相同的功能。

ii）離體模型

另一種方法是使用離體上皮細胞模型路幸，例如Caco-2細胞和腸源性器官樣體(enteroids)荐开。Caco-2細胞最初來源于人類結腸癌，可以作為一個極化的單層細胞生長简肴，細胞之間形成緊密連接晃听。因此，Caco-2細胞一直是體外培養(yǎng)腸上皮細胞的主要細胞系砰识。然而能扒，該細胞系在很多方面存在局限。首先辫狼，Caco-2單層只有一種細胞類型初斑，而腸道上皮包括多種類型的細胞，包括腸上皮細胞膨处、杯狀細胞见秤、潘氏細胞、干細胞和內分泌細胞真椿。因此鹃答，它們無法重現(xiàn)腸道上皮的組織結構。其次突硝，這些細胞源自癌細胞挣跋，因此其生理特性可能與正常健康的上皮細胞不同。最后狞换，這種細胞系不是患者特異性的避咆，即不是原代細胞系。

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圖2.(a)類器官培養(yǎng)程序概述腺占。(b)單層類器官模型示意圖淤袜。

腸道類器官培養(yǎng)的備選細胞來源包括誘導性多能干細胞(iPSCs)、胚胎干細胞(ESCs)以及流產胎兒的腸道碎片衰伯。這些細胞系的一個優(yōu)點是它們不依賴于新生兒手術铡羡，因此也不局限于典型的非健康組織。此外意鲸，iPSCs和ESCs的分化模擬了胚胎生長烦周，因此為研究腸道發(fā)育提供了更好的模型。但要注意的是怎顾，這些細胞衍生的類器官和胎兒衍生的類器官與患者及其獨特表型(例如腸道菌群組成和對疾病的遺傳易感性)缺乏聯(lián)系论矾。

目前已開發(fā)出多種模型系統(tǒng)可用于利用類器官細胞系進行宿主-微生物研究，這些系統(tǒng)通常涉及將細菌顯微注入到3D類器官的腔內杆勇、逆轉3D類器官的極性，或者從類器官制作2D單層饱亿。顯微注射可保持類器官的3D結構蚜退，并允許系統(tǒng)內細菌的生理相關空間定位(見圖2(a))。逆轉3D類器官的極性包括將類器官由內而外翻轉彪笼，即基底外側表面位于腔內钻注，而頂側表面位于腔外。這種方法避免了繁瑣且技術上具有挑戰(zhàn)性的顯微注射配猫，因為只需將腸道微生物和營養(yǎng)物質添加到周圍的培養(yǎng)基中即可幅恋。

類器官單層是通過解離球狀類器官并將細胞播種在表面上制備的，最常用的是Transwell可滲透支架泵肄，如圖2(b)所示捆交。細胞之間的緊密連接重新形成極化的2D單層上皮。這種方法的主要優(yōu)點是Transwell系統(tǒng)允許基底外側腔室與頂腔室隔離腐巢。然后可以使頂腔室無氧品追，而基底側則保持含氧，這意味著可以建立跨腸道上皮的自然氧梯度冯丙。該方法已得到進一步發(fā)展肉瓦，允許將氧氣持續(xù)灌注到基底外側腔室，從而延長類器官培養(yǎng)的時間胃惜。然而泞莉，由于其是2D結構，這意味著單層培養(yǎng)犧牲了腸道的3D組織結構船殉。類器官單層也可以植入微流體系統(tǒng)鲫趁，以創(chuàng)建一個“腸道芯片”模型。這種系統(tǒng)提供的流體控制允許營養(yǎng)物質利虫、代謝物或微生物在嚴格的時空控制下連續(xù)灌注到單層上皮饮寞。這些系統(tǒng)可以重現(xiàn)上皮細胞在腸腔內通常受到的流體流動和剪切應力孝扛。此外，與3D類器官培養(yǎng)方法一樣幽崩，微流體系統(tǒng)缺乏腸道上皮細胞的生理氧梯度苦始。

雖然類器官模型有各種優(yōu)點，但也存在一定的局限性慌申。它們缺乏宿主微環(huán)境的組成部分陌选，如免疫細胞、神經元和腸道血管系統(tǒng)蹄溉。盡管存在正確的細胞類型咨油，但類器官無法形成真正的絨毛-隱窩結構，這意味著無法重建腸道的3D隔室柒爵。此外役电，類器官培養(yǎng)依賴于諸如Matrigel之類的基質和生長因子，這些生長因子的定義不明確棉胀，不同批次的生長因子不同法瑟，且價格昂貴。此外唁奢，類器官培養(yǎng)技術復雜且通量相對較低霎挟。

盡管如此，在重建宿主組織的功能復雜性方面麻掸，類器官仍然比單細胞類型的體外培養(yǎng)更有優(yōu)勢酥夭。目前已經開發(fā)了在類器官培養(yǎng)中引入其他細胞類型(如免疫細胞)的共培養(yǎng)系統(tǒng)，以增加這些模型組織的復雜性和生物學相關性脊奋。與動物模型相比熬北，在細菌共培養(yǎng)系統(tǒng)內使用類器官也提供了更大的靈活性，可用于研究新生兒腸道菌群的不同菌株如何與腸上皮相互作用诚隙。這些實驗可以闡明新生兒腸道微生物群中單個菌株的機制作用蒜埋。膠原蛋白支架也被開發(fā)用于在類器官內形成真正的絨毛-隱窩結構。最后最楷，類器官確實在一定程度上解決了新生兒組織供應不足的問題整份，因為培養(yǎng)干細胞本質上就是生長更多的組織。這使得可以從單塊腸道組織進行多輪實驗籽孙，并通過在不同研究團體之間共享已建立的類器官細胞系烈评，使研究成果具有可重復性。

結論

腸道菌群在新生兒生長發(fā)育中起著重要作用犯建，影響其生命早期和成年期的健康結局讲冠。新生兒研究面臨獨特的方法學挑戰(zhàn)，計劃開展這一領域工作的研究人員必須了解樣本采集适瓦、儲存和處理對結果的影響竿开。研究設計應確保隊列足夠大谱仪，包括任何重要的協(xié)變量，并克服潛在的混淆因素否彩，同時能夠代表更廣泛的感興趣人群疯攒。納入隨機對照試驗的人類實驗研究可以將腸道菌群的變化與干預效果聯(lián)系起來，從而進一步闡明潛在的機制列荔。實驗方法必須謹慎選擇敬尺，并盡可能標準化，以減少在檢測微生物組成分時引入的偏倚贴浙。新生兒腸道代表性模型也應得到優(yōu)化砂吞，并用于探索微生物群對新生兒宿主影響的生物學機制。最終崎溃，研究小組應該確保在力所能及的情況下共享克服這些挑戰(zhàn)的最佳實踐蜻直，以提高該領域的研究質量。

參考文獻：Jonathan A Chapman & Christopher J Stewart (2023) Methodological challenges in neonatal microbiome research, Gut Microbes, 15:1, 2183687, DOI: 10.1080/19490976.2023.2183687
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