評估從頭組裝結(jié)果
Bionano從頭組裝出光學(xué)圖譜CMAP可以和參考序列的CMAP進行比對，通過Access上可視化檢查參考基因組的組裝質(zhì)量傻唾，比較兩者間的不同投慈。
這里所用的CMAP圖譜來自于一篇發(fā)表在NC的擬南芥的基因組文章(原本計劃用他們的bnx文件介紹從頭組裝承耿，但是通訊作者根本不搭理我)，
光學(xué)圖譜的下載方式為:
wget https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/ft/byid/w4jcevedkbs-mac-74_bng_contigs2017.cmap
我們可以根據(jù)「三代組裝」使用minimap+miniasm對nanopore進行基因組組裝組裝出對應(yīng)的物理圖譜伪煤，
分析代碼如下:
#模擬酶切
perl /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/Pipeline/10252018/fa2cmap_multi_color.pl -i R05C0144.fa -e BspQI 1
# 兩個圖譜比較
python /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/Pipeline/10252018/runCharacterize.py \
-t /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/RefAligner/7915.7989rel/RefAligner \
-q kbs-mac-74_bng_contigs2017.cmap -r R05C0144_BSPQI_0kb_0labels.cmap \
-p /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/Pipeline/10252018 \
-a /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/RefAligner/7915.7989rel/optArguments_nonhaplotype_noES_irys.xml \
-n 10
運行之后會在當(dāng)前目錄下生成一個"alignref"文件夾加袋， 將其中的"q.cmap","r.cmap",".xmap"下載到本地，上傳到access中進行可視化
上圖中抱既，箭頭指示的部分可能就是光學(xué)圖譜能用于錨定其他contig的部分职烧，這就是下一節(jié)光學(xué)圖譜輔助組裝的原理。
光學(xué)圖譜輔助組裝
NGM(Next-Generation Mapping) Scaffold 流程:
- 為序列數(shù)據(jù)產(chǎn)生 in silico 圖譜
- 將序列和Bionano基因組圖譜進行比較防泵，找到兩者之間的沖突并嘗試解決
- 將不沖突的圖譜合并成 hybrid scafold
- 在序列圖譜和hybrid scaffold之間形成聯(lián)配
- 得到scaffold的AGP和FASTA文件
整個流程和Bionano Access完美整合蚀之，為使用者提供了方便的操作界面，用于對scafflod結(jié)果進行可視化捷泞。流程的腳本在"/opt/biosoft/Solve3.3_10252018/HybridScaffold/10252018"
單酶系統(tǒng)
流程控制腳本為: Solve3.3_版本日期HybridScaffold/版本日期/hybridScaffold.pl, 他接受輸入文件足删，輸出運行過程中的信息，產(chǎn)生輸出文件锁右，最后得到結(jié)果描述失受。
有四個必須文件: FASTA格式組裝結(jié)果，CMAP格式的Bionano 基因組圖譜組裝咏瑟，XML格式的配置文件拂到， RefAligner.
perl hybridScaffold.pl
-n FASTA格式序列 (必須)
-b BIonano CMAP文件 (必須)
-c Merge 的XML配置文件 (必須)
-r RefAligner運行工具路徑 (必須)
-o 輸出文件夾 (必須)
-B conflict filter level genome maps; 1,2 or3， 決定如何處理沖突响蕴，1表示不過濾谆焊，2表示在沖突處分割contig，3表示刪除沖突的contig浦夷，沒有-M時一定要加入
-N conflict filter level for sequences; 1,2 or 3辖试， 決定如何處理沖突，1表示不過濾劈狐，2表示在沖突處分割contig罐孝，3表示刪除沖突的contig，沒有-M時一定要加入
-f 是否覆蓋之前的輸出
-x 分別進行hybrid scaffold 和 genome map的相互比對
-y 為輸入的genome maps生成嵌合質(zhì)量分
-M 輸入手工解決過沖突的文件
-m: 如果使用了-x或-y參數(shù)肥缔，則需要輸入Bionano molecules的BNX文件
-p 從頭組裝流程的文件路徑莲兢，如果使用了-x或, -y 選項，就需要加入這一項
-q 從頭組裝流程的XML配置文件续膳，如果使用了-x或, -y 選項改艇，就需要加入這一項
-e 從頭組裝時的噪音參數(shù)， .errbin或err文件
-v 輸出流程版本信息
明確一點: -c 要求的XML文件真的不是無腦用坟岔，需要修改其中fasta2cmap的enzyme部分
實際運行案例:
cp /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/HybridScaffold/10252018/hybridScaffold_config.xml .
# 用vim修改hybridScaffold_config.xml中的enzyme
perl /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/HybridScaffold/10252018/hybridScaffold.pl \
-n R05C0144.fa \
-b kbs-mac-74_bng_contigs2017.cmap \
-c hybridScaffold_config.xml \
-r /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/RefAligner/7915.7989rel/RefAligner \
-o R05C0144 \
-B 2 -N 2 \
-f
運行過程中會輸出scaffold N50等一些參數(shù)谒兄。N50僅僅提升了1.1M，估計是作者bionano數(shù)據(jù)不夠多社付。
組裝的FASTA在"R05C0144/agp_fasta"文件下承疲，而"R05C0144/hybridScaffold_archive.tar.gz"可以上傳到Access查看組裝效果, 下圖就是一個典型的混合組裝
當(dāng)然具體分為哪幾步邻耕，以及每一步調(diào)用的腳本如下所示:
第一步： 將FASTA轉(zhuǎn)成CMAP格式,
用到一個perl腳本, fa2cmap_multi_color.pl, 通過對基因組序列進行模式搜索尋找可能的酶切位點，默認輸出在"fa2cmap"文件夾下
第二步: 識別并解決沖突燕鸽。
沖突可能來自于真實的等位基因兄世，或者時組裝錯誤，最終的結(jié)果就是在聯(lián)配中出現(xiàn)過多無法比對上的標(biāo)記(labels). Hybrid Scaffold流程會先用RefAligner將第一步得到的cmp去跟Bionano基因組圖譜比啊研，然后用AssignAlignType.pl識別沖突交界處御滩。輸入文件為RefAligner運行后得到的XMAP和CMAP文件，以及原始序列和原始Bionano基因組圖譜悲伶。統(tǒng)計每個聯(lián)配中比對和未必對標(biāo)記數(shù)艾恼，根據(jù)XML配置文件中"assignAlignType.max_overhang" 參數(shù)設(shè)置最大可以容忍的無法聯(lián)配的標(biāo)記數(shù)。最后會輸出"assginAlignType.xmap"(列出沖突位置),以及"assignAlignType_r.cmap"(無沖突序列), "assignAlignType_q.cmap"(無沖突圖譜)麸锉。更重要的是"conflicts.txt"钠绍，記錄著每個可能的位置。
之后流程用cut_conflicts.pl解決不一致的位置花沉， 輸出"conflicts_cut_status.txt", 可以手工編輯柳爽，有監(jiān)督的進行處理。
第三步: 合并兩者的組裝結(jié)果碱屁，形成Hybrid scaffold
這一步用MergeNGS_BN.pl腳本完成磷脯，它會調(diào)用RefAligner進行迭代兩兩配對合并，輸入文件是下面的其中一個
- 原始輸入
- 沖突解決后的組裝(
cut_conflicts.pl輸出結(jié)果) - 沒有沖突的組裝(
AssignAlignType.pl的結(jié)果)
每一種輸入都是一種選項娩脾，我們可以嘗試不同的輸入赵誓，最后進行比較。
第四步: 將序列圖圖譜和基因組圖譜比對到hybrid scaffold
第五步: 生成hybrid scaffold表征的AGP和FASTA文件
一些注意事項：
- Bionano很難處理Hi-C數(shù)據(jù)引起的基因組中朝向/排序的錯誤柿赊。所以先Bionano混合組裝俩功，然后才是Hi-C
- 覆蓋度: 至少50X，NLRS隨著覆蓋度提高并不會有明顯增強圖譜連續(xù)性碰声，DLS(例如DLE0-1) 100X以上的覆蓋度能夠明顯提高某些植物和東西的圖譜連續(xù)性诡蜓。
- 當(dāng)前的Hybrid Scaffold 流程無法很好處理單倍體信息，所以上一步的從頭組裝一定要是nonhaplotype.
