PMID: 34000456
DOI: 10.1016/j.jprot.2021.104266

摘要

化療耐藥是導(dǎo)致乳腺癌（BC）復(fù)發(fā)和癌癥相關(guān)死亡率高的主要因素锅论。聚糖的異常水平與化療耐藥性密切相關(guān)。糖鏈在化療耐藥中的基本功能尚未得到系統(tǒng)研究楣号。本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)最易、蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的綜合策略竖席，探討乳腺癌細(xì)胞化療耐藥中糖基因耘纱、聚糖結(jié)構(gòu)和糖蛋白的失調(diào)敬肚。在紫杉醇（PTX）耐藥的MCF7細(xì)胞中毕荐，鑒定出19種差異表達(dá)的N-聚糖相關(guān)蛋白，其中MGAT4A表達(dá)下調(diào)最為顯著艳馒，這與PTX處理的BC細(xì)胞中MGAT4A mRNA水平表達(dá)的降低一致憎亚。糖組學(xué)分析一致顯示使用MALDI-TOF/TOF-MS和凝集素微陣列抑制多觸角分支結(jié)構(gòu)的水平员寇。在PTX耐藥的MCF7細(xì)胞中，鑒定出幾種具有抑制水平的多觸角分支結(jié)構(gòu)的靶糖蛋白第美，并且ERK信號(hào)通路被強(qiáng)烈抑制蝶锋。我們的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了多觸角分支結(jié)構(gòu)及其靶糖蛋白在PTX抗性中的異常水平。系統(tǒng)整合的多組學(xué)分析有望促進(jìn)發(fā)現(xiàn)異常的糖基轉(zhuǎn)移酶什往、N-糖基化和糖蛋白在腫瘤進(jìn)展和化療耐藥中的作用扳缕。意義：轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)别威、糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的綜合策略對(duì)于理解多糖與BC化療耐藥之間的關(guān)系至關(guān)重要躯舔。在這項(xiàng)多組學(xué)分析中，我們確定了獨(dú)特的多糖相關(guān)蛋白省古、多糖和糖蛋白標(biāo)志物粥庄，這些標(biāo)志物定義了BC中的PTX耐藥性。這項(xiàng)研究可能為了解細(xì)菌耐藥性的分子機(jī)制提供有價(jià)值的信息豺妓。

個(gè)人關(guān)注方法惜互，感興趣本研究可詳細(xì)查看文獻(xiàn)結(jié)果和討論

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)

免疫印跡和凝集素印跡

流式細(xì)胞儀分析

凝集素微陣列分析

如前所述構(gòu)建和分析凝集素微陣列。簡(jiǎn)言之琳拭，來(lái)自Vector Labs训堆、Sigma-Aldrich或Merck（德國(guó)達(dá)姆施塔特）的37種凝集素以高空間密度固定在固體載體上。關(guān)于凝集素的碳水化合物親和力白嘁，請(qǐng)參考表S5蔫慧。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用Cy3熒光染料（GE Healthcare权薯；Perry Hall姑躲，MD，USA）標(biāo)記蛋白質(zhì)盟蚣。簡(jiǎn)而言之黍析，Cy3熒光染料在DMSO中溶解0。室溫下培養(yǎng)5h屎开，與蛋白質(zhì)在0阐枣。1mNa2CO3溶液（pH值9.3）持續(xù)2小時(shí)。室溫下5小時(shí)奄抽。通過(guò)在4℃下添加4 M羥胺10分鐘終止反應(yīng)?C.通過(guò)Sephadex G-25柱純化Cy3標(biāo)記蛋白蔼两，并將其應(yīng)用于凝集素微陣列。培養(yǎng)后逞度，用GenePix 4000B共焦掃描儀（Axon Instruments额划；美國(guó)加利福尼亞州聯(lián)合市）掃描載玻片。數(shù)據(jù)分析如前所述档泽。簡(jiǎn)言之俊戳，小于平均背景值的原始值被刪除揖赴。每個(gè)凝集素的有效數(shù)據(jù)中位數(shù)通過(guò)將每個(gè)中位數(shù)除以中位數(shù)之和進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并比較MCF7和MCF7-PTX細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)抑胎，以評(píng)估蛋白質(zhì)糖基化水平的相對(duì)變化燥滑。

N-聚糖的分析

蛋白質(zhì)提取與消化

如前所述，進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和消化阿逃。簡(jiǎn)言之铭拧，用冷PBS沖洗細(xì)胞，用8 M尿素/1 M NH4HCO3溶解細(xì)胞恃锉，然后進(jìn)行超聲處理羽历。收集上清液并用10mM DTT、20mM IAM（Sigma-Aldrich）變性蛋白質(zhì)（每個(gè)樣品1mg）淡喜，用賴氨酰內(nèi)肽酶（Wako Pure Chemical秕磷；日本大阪）在37℃下以1:100（w/w）消化4h?C作為第一個(gè)消化步驟，然后用胰蛋白酶（Promega炼团；美國(guó)威斯康星州麥迪遜）以1:100（w/w）在37℃下消化過(guò)夜?C.通過(guò)離心收集肽澎嚣，并使用Oasis HLB筒（Waters；美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德）進(jìn)行純化瘟芝。

數(shù)據(jù)獨(dú)立采集的蛋白質(zhì)組學(xué)分析（DIA）

為了生成質(zhì)譜（MS）庫(kù)易桃，首先進(jìn)行了數(shù)據(jù)相關(guān)采集（DDA）的LC-MS/MS分析。肽在10mM NH3中重新懸浮?H2O锌俱，并以100μL/min的速度加載到C18柱（Xbridge BEH300晤郑；Waters）上，使用Ultimate 3000 HPLC（ThermoFisher）贸宏。緩沖液a為10 mM NH3?H2O造寝；緩沖液B為10 mM NH3?90琋中的H2O。以1分鐘的間隔手動(dòng)收集分?jǐn)?shù)吭练，并連接到18個(gè)分?jǐn)?shù)诫龙。將每個(gè)部分溶解在加載緩沖液（0.1% FA）中，并以1:10（v/v）與iRT肽（Biognosys鲫咽；Schlieren签赃，Switzerland）混合，并將其置于帶有2μm PepMap C18珠的納米柱中分尸，并用EASY nLC 1200系統(tǒng)（ThermoFisher）以以下梯度分離：0-4分鐘锦聊，3-6%B；4-137分鐘箩绍，6-30%硼孔庭；137–147分鐘，30%–90%伶选，147–150分鐘史飞，90%–90%尖昏；總梯度為150min仰税。在Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS（ThermoFisher）上构资，采用數(shù)據(jù)相關(guān)方法和最高速度模式獲取MS數(shù)據(jù)，參數(shù)如下：噴霧電壓2kV陨簇；S透鏡射頻電平30吐绵；毛細(xì)管溫度300?C全掃描分辨率60000 m/z 200，自動(dòng)增益控制（AGC）4e5河绽，最大填充時(shí)間30毫秒己单；全質(zhì)量范圍為350–1500；HCD以m/z 200和AGC 5E4掃描分辨率15000耙饰；HCD掃描的最大離子注入時(shí)間為30 ms纹笼；固定第一質(zhì)量110；歸一化碰撞能量（CE）30苟跪；MIPS“肽”廷痘；具有單一、未分配電荷狀態(tài)的前體離子從碎片選擇中移除件已；動(dòng)態(tài)排除40s笋额；循環(huán)時(shí)間3s。使用MaxQuant軟件包（V.1.5.6.0）[33]分析DDA數(shù)據(jù)篷扩。蛋白質(zhì)和肽的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）設(shè)置為1%兄猩。碎片光譜由Andromeda搜索引擎與瑞士Prot人類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)（V.201502；20534條目）結(jié)合262種常見(jiàn)污染物進(jìn)行搜索鉴未。生成的MaxQuant MS/MS.txt文件導(dǎo)入到軟件程序Spectronaut V.13（Biognosys）中枢冤，默認(rèn)設(shè)置用于生成光譜庫(kù)。

為了對(duì)DIA進(jìn)行LC-MS/MS分析铜秆，使用與上述DDA相同的LC分析肽掏导。如上所述，在Orbitrap Fusion MS上獲取DIA羽峰。每個(gè)MS循環(huán)包含一個(gè)完整的MS（R 60000@200 Th趟咆，AGC為2e5，最大離子注入時(shí)間為20 MS梅屉，質(zhì)量范圍為350–1200值纱，標(biāo)準(zhǔn)化CE為32%，MS2 200–2000的質(zhì)量范圍）和80次直徑掃描（R 30000@200 Th坯汤，AGC為5E5虐唠，最大離子注入時(shí)間為55 MS）。循環(huán)時(shí)間約為6周惰聂。使用Spectronaut V.13[34]對(duì)47個(gè)s.DIA文件進(jìn)行了定位疆偿，并使用生成的光譜庫(kù)進(jìn)行了提取咱筛。原始MS數(shù)據(jù)文件使用HTRMS轉(zhuǎn)換器（Biognosys）轉(zhuǎn)換為HTRMS文件。HTRMS文件已導(dǎo)入Spectronaut杆故，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值迅箩。使用Q值0過(guò)濾DIA結(jié)果。01表示肽和蛋白質(zhì)水平处铛。

糖肽富集及LC-MS/MS分析

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

如前所述進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析饲趋。簡(jiǎn)單地說(shuō)，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)是從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中提取的撤蟆，置信限為0.4（medium confidence level in STRING）表示所有顯著表達(dá)的蛋白質(zhì)奕塑。使用Clustermaker2在Cytoscape中的Network上執(zhí)行MCL聚類(lèi)。使用Cytoscape中的STRING應(yīng)用程序進(jìn)行GO富集分析家肯，并使用FDR值突出顯示顯著富集的生物過(guò)程龄砰。

GEO數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE116446(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE116446)，基于GPL571平臺(tái)數(shù)據(jù)(Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array)和R(v.4.0.3)中的Geoquery讨衣，從NCBI的Gene expression omnibus (GEO)上下載换棚。基因表達(dá)數(shù)據(jù)作為Series Matrix數(shù)據(jù)存儲(chǔ)值依，用于基因表達(dá)倍數(shù)變化分析圃泡，基因表達(dá)倍數(shù)變化定義為一個(gè)細(xì)胞系在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)藥物暴露與相應(yīng)的零濃度之間的log2表達(dá)差異。

磷酸激酶陣列分析

根據(jù)制造商的說(shuō)明(ARY003B; R&D Systems; Minneapolis, MN, USA)愿险。使用Image J軟件程序(NIH)對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算和量化颇蜡。通過(guò)將重復(fù)點(diǎn)的平均強(qiáng)度除以陣列上參考點(diǎn)的平均強(qiáng)度，將數(shù)據(jù)歸一化辆亏，并表示為相對(duì)于陣列上參考點(diǎn)的平均強(qiáng)度风秤。

數(shù)據(jù)分析

所有的實(shí)驗(yàn)都至少重復(fù)了三次。兩組間糖組數(shù)據(jù)集比較采用雙尾t檢驗(yàn)扮叨，p <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義缤弦。蛋白質(zhì)組和糖蛋白組數(shù)據(jù)集的比較采用benjamin - hochberg (BH)方法進(jìn)行多重比較FDR校正，認(rèn)為與Benjamini-Hochberg FDR <0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義彻磁。采用GraphPad Prism V. 7.0軟件程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析碍沐。