在最近公布的《2023年十大新興技術(shù)報(bào)告》中拨匆，空間組學(xué)被評(píng)為十大新興技術(shù)之一贬循，其中的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（ST-seq）技術(shù)已成為探索細(xì)胞生物學(xué)未知領(lǐng)域的強(qiáng)有力工具根灯。空間轉(zhuǎn)錄組可以揭示組織內(nèi)的基因表達(dá)空間分布的異質(zhì)性搞疗，為研究組織空間表達(dá)圖譜茁裙、組織發(fā)育變化和疾病發(fā)生機(jī)制提供了新的視角喻鳄。本次FAQ將集中討論空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在樣本準(zhǔn)備以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面主要關(guān)心的問題郊酒。??
Q1：冷凍包埋樣本做空間轉(zhuǎn)錄組應(yīng)該怎么處理？
新鮮冷凍樣本的包埋嗓奢，是空間轉(zhuǎn)錄組的重要前處理步驟，通彻傻ⅲ可以采用以下兩種方式進(jìn)行包埋：
先冷凍后包埋法：新鮮組織樣本取下后要迅速用預(yù)冷的鑷子將新鮮組織浸沒在異戊烷至組織完全冷凍根盒，然后進(jìn)行OCT包埋。
冷凍同時(shí)包埋：若無異戊烷物蝙，也可將包埋與冷凍同時(shí)進(jìn)行炎滞。將新鮮組織放在培養(yǎng)皿中，加入室溫的OCT包埋劑诬乞，讓組織外包裹一層OCT册赛，然后將組織置于包埋盒中并加入OCT包埋劑，最后放置在碎干冰上（或異戊烷中）冷凍震嫉。
Q2：樣本能否直接液氮凍存森瘪？
不可以液氮直接速凍，直接液氮處理可能在沸騰過程中使組織周圍形成空穴票堵，導(dǎo)致不同區(qū)域降溫不同步而改變內(nèi)部形態(tài)扼睬，甚至組織碎裂。
Q3：石蠟包埋塊可以存放多長(zhǎng)時(shí)間悴势？
石蠟樣本在包埋和保存的過程中會(huì)產(chǎn)生很多降解RNA的因素痰驱，另外因時(shí)間和存放條件的不同，RNA降解的速率也不一樣瞳浦，因此無法僅僅依靠存放年限來判斷樣本是否可用。目前主要通過檢測(cè)樣本RNA的DV200（片段長(zhǎng)度大于200nt的RNA比例）指標(biāo)來確定废士，大于30%才可使用叫潦。
Q4：空間轉(zhuǎn)錄組適用的樣品類型？
目前除了皮膚官硝、骨頭等特殊樣本類型需要評(píng)估優(yōu)化之外矗蕊，大部分組織類型都可適用于空間轉(zhuǎn)錄組。根據(jù)樣本處理方式氢架，適用的物種類型也有不同：
鮮冷凍樣本通過mRNA的ploy A結(jié)構(gòu)進(jìn)行捕獲傻咖，可以適用于多個(gè)物種，包括：人類岖研、小鼠卿操、大鼠警检、斑馬魚等等。
10x?Visium?版本的FFPE樣本通過目標(biāo)探針的方式進(jìn)行mRNA捕獲害淤，僅適用于人類和小鼠樣本扇雕。
華大Stereo-seq版本的FFPE樣本通過隨機(jī)探針的方式進(jìn)行RNA捕獲，適用于所有物種窥摄，可以同時(shí)檢出非編碼RNA以及微生物RNA镶奉。
Q5：與冷凍包埋樣本相比，石蠟包埋樣本有什么特點(diǎn)崭放？
[if !supportLists]1）?[endif]研究的性質(zhì)不同哨苛，石蠟包埋樣本可以保存的時(shí)間更加長(zhǎng)久，可以對(duì)之前的樣本進(jìn)行回顧性研究币砂，而新鮮冷凍包埋樣本如果長(zhǎng)期保存建峭，可能會(huì)導(dǎo)致因冰晶形成而破壞組織結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生RNA彌散道伟。
[if !supportLists]2）?[endif]可以彌補(bǔ)部分組織樣本透化效果不佳的缺點(diǎn)迹缀。石蠟包埋樣本采用探針結(jié)合的方式捕獲mRNA，無需經(jīng)過透化實(shí)驗(yàn)摸索蜜徽，對(duì)于透化效果不佳的組織類型祝懂，可以考慮采用石蠟包埋的方式。
Q6：骨頭樣本是否可以進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組拘鞋？
可以砚蓬，但存在風(fēng)險(xiǎn)。一是骨頭樣本粘附性不強(qiáng)盆色，容易脫片灰蛙，通常需進(jìn)行脫鈣處理苞慢，以增強(qiáng)其在玻片上的粘附性巧还。二是骨頭樣本的細(xì)胞密度低，細(xì)胞的RNA含量低卖漫，導(dǎo)致最終單個(gè)spot點(diǎn)捕獲的細(xì)胞數(shù)少宣旱，中位基因數(shù)低仅父。
Q7：植物樣本是否可以做空間轉(zhuǎn)錄組？
植物樣本可以通過ploy A結(jié)構(gòu)進(jìn)行捕獲浑吟，但存在容易脫片的問題笙纤。同時(shí)植物樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在多種不同的細(xì)胞類型组力，以及細(xì)胞壁的存在省容，這些都會(huì)增加透化過程的復(fù)雜性，可能還需要對(duì)透化試劑進(jìn)行優(yōu)化燎字。另外腥椒，植物樣本建議使用新生幼嫩的組織阿宅，成熟的組織RNA含量低，很少有基因表達(dá)寞酿。
Q8：做空間轉(zhuǎn)錄組需要幾個(gè)生物學(xué)重復(fù)
目前做空間轉(zhuǎn)錄組是可以不做生物學(xué)重復(fù)的家夺，一是空間轉(zhuǎn)錄組屬于新興的技術(shù)，就像單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組剛出現(xiàn)的時(shí)候伐弹，往往不會(huì)對(duì)生物學(xué)重復(fù)有明確的要求拉馋。二是空間轉(zhuǎn)錄組的生物學(xué)重復(fù)并不好實(shí)現(xiàn)，只有在樣本的空間結(jié)構(gòu)存在某種程度的一致性時(shí)才有可能實(shí)現(xiàn)惨好。
Q9：關(guān)于腫瘤樣本的研究煌茴，如何取樣？
腫瘤作為全球主要的健康挑戰(zhàn)之一日川，因其復(fù)雜的分子機(jī)制和治療抵抗性蔓腐，所以一直是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)關(guān)注方向。對(duì)于腫瘤樣本龄句，通郴芈郏可以采取以下兩種取樣方式：
1） 選取腫瘤與周邊區(qū)域，這種取樣方式側(cè)重于研究腫瘤的微環(huán)境分歇。通過空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序傀蓉，比較腫瘤的核心區(qū)，侵襲前沿區(qū)职抡，以及周邊健康組織區(qū)域細(xì)胞組成比例的變化葬燎，挖掘關(guān)鍵的細(xì)胞互作以及分子調(diào)控機(jī)制。當(dāng)腫瘤較小時(shí)缚甩，可以直接把腫瘤與周邊健康區(qū)域一起檢測(cè)谱净。當(dāng)腫瘤較大時(shí)，可能需要分別取腫瘤核心區(qū)擅威，侵襲前沿區(qū)壕探，以及周邊健康區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)。
2） 選取不同時(shí)間點(diǎn)/處理下的腫瘤樣本郊丛，這種取樣方式側(cè)重于研究不同腫瘤之間的異質(zhì)性浩蓉。例如可以根據(jù)治療效果，選擇預(yù)后良好與預(yù)后效果不好的腫瘤作為比較宾袜。
Q10：?jiǎn)渭?xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合，樣本如何設(shè)計(jì)驾窟？
空間轉(zhuǎn)錄組可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本在組織空間位置的還原庆猫，但由于每個(gè)spot點(diǎn)或者每個(gè)bin里面是包含了若干個(gè)細(xì)胞（1-10個(gè)細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄本信息，因此沒法確切知道該位置由哪些細(xì)胞構(gòu)成绅络。為了解決這一問題月培，目前有不少文章采用了單細(xì)胞結(jié)合的方式嘁字，通過不同的反卷積算法，推算出空間位置的細(xì)胞組成比例杉畜。關(guān)于與單細(xì)胞聯(lián)合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)纪蜒，目前主要有以下幾種方法。
1）收集樣本的時(shí)候?qū)颖疽环譃槎说环萦糜趩渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組纯续，一份用于空間轉(zhuǎn)錄組。該方案需要樣本為新鮮樣本灭袁，且樣本制備單細(xì)胞懸液效果好猬错。但是需要注意樣本的分割均勻，如果樣本的細(xì)胞組成分布差異極大茸歧，該方法可能會(huì)導(dǎo)致兩組學(xué)關(guān)聯(lián)性下降倦炒，例如腫瘤可能就不太適用。
2）收集樣本的時(shí)候软瞎，采用新鮮冷凍包埋的方式逢唤，先進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析，剩余的樣本先放-80度冰箱保存涤浇，根據(jù)空間轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果鳖藕，選擇符合預(yù)期的樣本后再對(duì)剩余的組織樣本進(jìn)行細(xì)胞核懸液制備。這種方式的好處是比較靈活芙代，可以先根據(jù)空間轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果再去做單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組吊奢。但是這種處理方式的單細(xì)胞只能提細(xì)胞核懸液，對(duì)樣本的保存要求比較高纹烹。
3）收集的樣本只做空間轉(zhuǎn)錄組分析页滚，單細(xì)胞數(shù)據(jù)選用已經(jīng)公開發(fā)表的單細(xì)胞數(shù)據(jù)。這種方式好處是成本最低铺呵，但是不同樣本之間會(huì)存在異質(zhì)性裹驰，導(dǎo)致兩組學(xué)關(guān)聯(lián)性降低，并且受限于已經(jīng)公開發(fā)表的數(shù)據(jù)集片挂。
總的來說幻林，如果經(jīng)費(fèi)允許的話，最好還是用前兩種方式音念，樣本的關(guān)聯(lián)效果最好沪饺。如果經(jīng)費(fèi)有限，且該樣本的單細(xì)胞數(shù)據(jù)豐富闷愤，也可采用第三種最具性價(jià)比的方式整葡。
Q11：10x visium HD相比其他空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)有什么特點(diǎn)？
10x Visium HD對(duì)芯片結(jié)構(gòu)進(jìn)行了全新升級(jí)讥脐，芯片有兩個(gè)捕獲區(qū)域遭居，每個(gè)捕獲區(qū)域?yàn)?.5mm*6.5mm啼器，每個(gè)區(qū)域由2μm*2μm的小正方形組成。該芯片主要有兩大特點(diǎn)：
1）可以對(duì)組織無間隙覆蓋俱萍，完整保留了組織所有區(qū)域的生物學(xué)信息端壳；
2）以單細(xì)胞分辨率對(duì)組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組空間分析；
該技術(shù)采用探針捕獲的方式枪蘑，針對(duì)人和小鼠分別設(shè)計(jì)了約18000個(gè)和19000個(gè)基因的探針對(duì)损谦，目前僅適用于人和小鼠的FFPE樣本。
Q12: 空間轉(zhuǎn)錄組與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組做關(guān)聯(lián)腥寇，樣本是否需要一一配對(duì)成翩？
空間轉(zhuǎn)錄組與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合，主要是利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中不同細(xì)胞類型的表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)赦役，用于空間spot點(diǎn)的反卷積計(jì)算麻敌。因此，推薦每一種組織類型可以做一個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組掂摔，即單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的細(xì)胞類型是重合的术羔。例如，有幾個(gè)空轉(zhuǎn)的樣本都來自于同一個(gè)患者的同一個(gè)組織乙漓，針對(duì)這幾個(gè)樣本可以只做一個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組级历。
Q13：可以總結(jié)梳理目前不同空轉(zhuǎn)技術(shù)的對(duì)比嗎？
目前主流的空間轉(zhuǎn)錄組平臺(tái)主要有10x?Visium系列和華大Stereo-seq系列叭披，兩者都可以做FF樣本（新鮮冷凍樣本）和FFPE（石蠟包埋樣本）寥殖，具體技術(shù)對(duì)比如下：
本期的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序常見問題解答就到這里啦，如果還有其他感興趣的問題涩蜘，也歡迎隨時(shí)與我們聯(lián)系嚼贡，我們下期見~
