單細胞測序方法和原理系列：
1. DNA文庫構(gòu)建
所謂DNA文庫钾埂，實際上是許多個DNA片段屏歹，在兩端接上了特定的DNA接頭攻臀，形成的DNA混合物。
文庫有2個特點：
1. 當中這一段插入的DNA，它的序列是各種各樣的。
2. 它的兩頭的街頭序列现使，是人工特異加上去的低匙，是已知的。
要構(gòu)建文庫碳锈，首先需要把基因組DNA用超聲波打斷顽冶，之后把兩端用酶補平。再用Klenow酶在3’端加上一個A堿基售碳，然后再用連接酶把接頭給連上去强重。連好了接頭的DNA混合物，我們就稱為一個文庫贸人。
2. Illumina測序化學原理
Illumina儀器對比间景。從最早的Miseq一天測三千萬條read，到Hiseq一天測30億條reads灸姊，再到Novaseq一天可以測130億條read拱燃，通量還是有一個非常大的提升秉溉。
2.1橋式PCR
文庫構(gòu)建好之后力惯，后續(xù)就是做橋式PCR。橋式PCR是把文庫種到芯片上去然后進行擴增的這樣一個過程召嘶。
1）首先要把文庫加到芯片上父晶。芯片的內(nèi)表面種滿兩種不同類型的oligo(寡核苷酸序列)。因為文庫兩頭的DNA序列和芯片上的引物是互補的弄跌，就可以發(fā)生互補雜交甲喝。
2）隨后加入dNTP和聚合酶，聚合酶會從引物開始铛只，延著模版合成出一條全新的DNA鏈來埠胖。新的這條鏈和原來的鏈是完全互補的。
3）接下來加入NaOH堿溶液淳玩，DNA在NaOH堿溶液存在的情況下直撤，就解鏈了。液流一沖蜕着，原來的模版鏈（沒有和芯片共價連接的鏈）就會被沖走谋竖，和芯片共價連接的 鏈就會被保留你雌。
4） 再往液流池中加入中性液體（中和前面加入的堿液）爷怀，這時DNA鏈上的另外一端就會和玻璃板上的第二種引物發(fā)生互補雜交掖棉。
5）加入酶和dNTP勇边，聚合酶就沿著第二個引物合成出一條新的鏈來醋界。
6）然后再加堿市栗，把兩條鏈解鏈開姿鸿，再加入新的中和液榨了，這時候DNA鏈就會和新的引物雜交袍暴。再加酶些侍，再加dNTP握牧，又從新的引物上合成出新的鏈來。連續(xù)重復這一過程娩梨，DNA鏈的數(shù)量就會以指數(shù)方式增長沿腰。
2.2 雙鏈變單鏈
橋式PCR完成之后，接下來需要把合成的雙鏈變成可以測序的單鏈狈定。辦法是通過一個化學反應(yīng)颂龙，把一個引物上的一個特定基團給切斷掉，然后再用堿溶液來洗芯片纽什。堿讓DNA雙鏈解鏈措嵌，那根被切斷了根的DNA鏈就被水沖掉了，留下那根共價鍵連在芯片上的鏈芦缰。接下來加入中性溶液企巢，再在這個中性溶液里加入測序引物，隨后就可以開始正式的測序工作了让蕾。
2.3 測序
在測序的時候加進去的主要是兩個東西浪规，一是帶熒光標記的dNTP（3‘末端是被一個疊氮基堵住的），二是聚合酶探孝。聚合酶就會選擇哪個dNTP是和原來位置上的那個堿基是互補的笋婿，根據(jù)互補性原理，把這個dNTP合成到新的鏈上去顿颅。
因為dNTP的3‘端是被一個疊氮基團堵住的缸濒，所以它一個循環(huán)只能延長一個堿基。合成之后粱腻，用水把多余的dNTP和酶給沖掉庇配，放到顯微鏡下去進行激光掃描，根據(jù)發(fā)出來的熒光判斷它是哪個堿基绍些。因為4種dNTP上面標記的熒光素都不一樣捞慌，根據(jù)熒光就可以判斷新合成的堿基是什么堿基。因為新合成的堿基和原來位置的堿基是互補的遇革，就可以知道模版鏈的堿基是什么卿闹。
一個循環(huán)完成之后，就加入一些化學試劑萝快，把疊氮基團和旁邊標記的熒光基團切掉锻霎。切掉之后，3‘端的羥基就暴露出來揪漩，接下來加入新的dNTP和新的酶旋恼，就又延長一個堿基。之后把多余的酶和dNTP沖掉奄容，再進行一輪顯微的激光掃描冰更，判斷堿基是什么产徊。重復這個過程，就可以把上百個甚至更多個堿基的序列讀出來蜀细。
2.4讀取Index (Barcode)
因為illumina的測序量很大，但一個樣本往往用不了幾億條DNA奠衔。所以科學家就想了一個辦法谆刨，在文庫的接頭上做了一些標記，每一個樣本有一個特定的接頭归斤，每個接頭里面有一段特定的序列痊夭，這段特定的序列，我們就稱為Index/Barcode（特定序列標記了特定樣本的來源）脏里。
要讀Index序列她我，先用堿把上面這跟測完‘Read 1’的序列上面的DNA鏈解鏈掉，加入中性液迫横，再加入‘Read 2’的測序引物番舆。Read 2的結(jié)合位點就在Index序列的旁邊，接下來進行第二輪測序员淫。一般是讀6-8個堿基合蔽。讀完以后就可以知道這某一個具體的一段DNA，它來自原始的哪個樣本介返。
2.5 雙端測序
這是Illumina的最核心的另外一個技術(shù) 。雙端測序就是一根DNA鏈沃斤，除了從正向讀一遍圣蝎，還可以從DNA的負向再讀一遍。這樣子就把Illumina測序的有效長度加了一倍衡瓶。
這個倒鏈的過程徘公，是先讓DNA合成，得到互補鏈哮针。之后用化學試劑切斷模版鏈根部关面，加入堿溶液洗掉，接下來就進行第2端的測序十厢。原理和第1端是一樣的等太。
最重要的是，我們可以理解蛮放，一個點經(jīng)過幾百個循環(huán)得到一條鏈幾百個堿基的信息缩抡。但實際上這個芯片可以有上億個點，也就是上億個cluster（簇）包颁。上億個鏈同時在合成瞻想，因此每一個循環(huán)都可以讀出上億個序列压真，這就得到了很大的一個測序數(shù)據(jù)量。
2.6 Limits
reads越長蘑险，出錯的越多滴肿，真實信號會越來越弱。因此illumiina的測序讀長被限制在300bp以內(nèi)佃迄。
參考：
