System analysis based on the pyroptosis-related genes identifies GSDMC as a novel therapy target for pancreatic adenocarcinoma
基于細胞焦亡相關基因的系統(tǒng)分析確定GSDMC為胰腺癌的新型治療靶點
發(fā)表期刊：J Transl Med
發(fā)表日期：2022 Oct 5
影響因子：8.440
DOI:? 10.1186/s12967-022-03632-z
一扳还、研究背景
????????PAAD是一種以快速擴散和預后不良為特征的癌癥腫瘤哄陶。研究表明帆阳，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率幾乎相等，大多數(shù)PAAD患者在被診斷時已經(jīng)患有晚期疾病屋吨。然而蜒谤，高達80%的胰腺癌因其高度惡性和早期轉移而不能被切除。
????????細胞焦亡是一種由炎癥性caspases誘導的調節(jié)性壞死細胞死亡离赫。它主要依靠炎癥激活Caspase家族的一部分蛋白芭逝，使炎癥裂解Gasdermin蛋白，激活Gasdermin蛋白渊胸，被激活的Gasdermin蛋白轉運到細胞膜上形成孔洞旬盯，然后細胞膨脹，細胞膜破裂，最后導致細胞質外流胖翰，形成細胞焦亡接剩。
二、材料與方法
1萨咳、數(shù)據(jù)來源
1） 從TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中下載了178份PAAD樣本和167份正常胰腺樣本的RNA測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)及其臨床病理參數(shù)
2） 186個PAAD樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床病理特征從GEO? GSE71729和GSE57495數(shù)據(jù)集下載
在進一步分析之前懊缺，基因表達數(shù)據(jù)通過“Sanger box”工具進行標準化（http://sangerbox.com/）
2、分析流程
1）識別差異表達的細胞焦亡相關基因：使用"DESeq2 "軟件包來識別PAAD樣本和正常樣本中差異表達的細胞焦亡相關基因培他；蛋白質相互作用（PPI）通過使用string進行繪制
2）差異表達的焦亡相關基因的富集分析：用GO和KEGG分析了25個差異表達基因的生物過程富集情況鹃两；進行了基因集富集分析（GSEA）
3）預后基因的鑒定：單變量Cox回歸分析、LASSO Cox回歸舀凛、在單變量Cox回歸的基礎上進行多變量Cox回歸分析
4）基于細胞焦亡相關基因的預后模型的構建和驗證：根據(jù)訓練組中集中和標準化的PAAD mRNA表達數(shù)據(jù)俊扳，計算風險分數(shù)；利用GEO數(shù)據(jù)庫中的PAAD隊列進行了驗證猛遍；單變量和多變量的Cox回歸分析
5）nomogram和校準曲線的構建
6）藥物敏感性分析：使用R軟件中的pRRophetic包馋记，計算高危組和低危組中每個患者的每個小分子化合物的敏感性得分；使用PubChem網(wǎng)站將藥物的構象在三維中可視化
7）實驗：細胞培養(yǎng)懊烤、CCK8檢測梯醒、EdU測定、傷口愈合實驗腌紧、蛋白印跡法茸习、慢病毒的生產、感染和穩(wěn)定細胞系的構建寄啼、細胞周期分析逮光、細胞的化學處理
三代箭、實驗結果
01 - 構建基于訓練集中細胞焦亡相關基因的預后模型
????????作者從TCGA獲得178名PAAD患者墩划，從GTEx獲得167個正常組織，從33個細胞焦亡相關基因中共識別出25個不同表達的細胞焦亡相關基因嗡综。在PAAD患者中乙帮，火山圖、熱圖和箱線圖顯示极景，16個細胞焦亡相關基因明顯下調察净，而9個細胞焦亡相關基因則上調（圖2A，C盼樟，D）氢卡。這些差異表達的細胞焦亡相關基因的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡顯示在（圖2B）。此外晨缴，在這些差異表達的細胞焦亡相關基因中译秦，觀察到PAAD患者的許多突變（圖2E）。
????????為了更好地了解不同表達的細胞焦亡相關基因的功能，進行了GO和KEGG通路富集分析筑悴。GO富集分析顯示们拙，這些差異表達的細胞焦亡相關基因主要與細胞因子產生的正式調節(jié)和對細菌的防御反應有關（圖S1A）。此外阁吝，對KEGG的分析顯示砚婆，這些差異表達的焦亡相關基因涉及鉑類藥物抗性、細胞凋亡-多物種突勇、ERbB信號通路和細胞凋亡（圖S1B）装盯。這表明，這些焦亡相關基因除了參與細胞焦亡外甲馋，還參與其他生物過程验夯。
????????如圖3A所示，用單變量Cox回歸分析篩選出9個細胞焦亡相關基因摔刁，包括5個潛在風險基因（IL18挥转、GSDMC、NLRP2共屈、CASP8和CASP4）和4個潛在保護基因（PLCG1绑谣、GPX4、PRKACA和NLRP1）拗引。在單變量Cox回歸的基礎上借宵，再進行LASSO回歸分析（圖3C，D）矾削。接下來壤玫，用IL18、CASP4哼凯、NLRP1欲间、NLRP2和GSDMC通過LASSO回歸構建了預后的細胞焦亡相關模型。最后断部，進行了多變量的Cox回歸分析猎贴，確定了三個與細胞焦亡相關的基因，其中兩個是潛在的風險基因蝴光，一個是潛在的保護基因（圖3B）她渴。
????????作者為所有的癌癥樣本構建了一個預后指數(shù)，計算公式為：風險分數(shù)=IL18的表達水平×0.002067+GSDMC的表達水平×0.034755+NLRP2的表達水平×0.028693+PLCG1的表達水平×（-0.00285）+NLRP1的表達水平×（-0.05665）+CASP4的表達水平×0.036385蔑祟。為了證實這個與細胞焦亡有關的模型是否能預測PAAD患者的預后趁耗，根據(jù)中位風險評分的閾值將170名患者分為高風險組（n = 85）和低風險組（n = 85）（圖4A）。與低風險組相比疆虚，高風險組的死亡率更高苛败，生存時間更短右冻。分數(shù)越高與PAAD患者的預后越差有關（圖4C）。IL18著拭、CASP4纱扭、GSDMC和NLRP2在高危組高表達，NLRP1在高危組低表達（圖4D）儡遮。Kaplan Meier曲線顯示乳蛾，高危組患者的預后較差（圖4B）。時間依賴性ROC分析顯示鄙币，1年時OS的預后準確性為0.673肃叶，3年時為0.768，5年時為0.790（圖4E）十嘿。
????????為了驗證所建立的預后模型的準確性因惭，作者從GEO獲得了186名胰腺癌患者，并使用訓練集的相同公式計算風險得分绩衷。根據(jù)風險評分的中值蹦魔，GEO隊列中的99名患者被分為低風險組，87名患者被分為高風險組（圖S2A）咳燕。低風險組的病人比高風險組的病人有更長的生存時間（圖S2C）勿决。IL18、CASP4招盲、GSDMC和NLRP2在高危組高表達低缩，NLRP1在高危組低表達（圖S2D）。此外，Kaplan Meier分析也表明，低危組和高危組的生存率明顯不同（圖S2B）甘邀，這與訓練集的結果一致。時間依賴性ROC分析顯示玩般，OS的預后準確性在1年時為0.590，3年時為0.554蜕衡，5年時為0.658（圖S2）壤短。
02 - 風險分數(shù)和臨床特征的獨立預后分析设拟，構建nomogram
????????為了驗證風險分數(shù)和臨床特征是否可以作為獨立的預后因素慨仿，進行了單變量和多變量的獨立預后分析。單變量獨立預后分析結果顯示纳胧，年齡镰吆、N期和風險評分與PAAD患者的OS明顯相關。多變量獨立預后分析顯示跑慕，風險評分可以是一個獨立的預測因素万皿。此外摧找，評估了細胞焦亡相關基因的表達與臨床特征之間的關系。結果顯示牢硅，NLRP1與等級蹬耘、N、T階段呈負相關减余。NLRP2與等級呈正相關综苔。GSDMC與分期呈負相關。CASP4與等級呈正相關位岔。風險評分與等級呈正相關如筛。基于這些研究結果抒抬，我們得出結論杨刨，模型可以成為一個可靠的預后生物標志物。
????????為了給臨床醫(yī)生提供一個更好的定量方法來預測PAAD患者的預后擦剑，建立了一個結合年齡妖胀、性別、N惠勒、T和風險分數(shù)的nomogram做粤，風險分數(shù)是各種臨床參數(shù)中的一個重要因素（圖5A）。此外捉撮，還構建了校準曲線怕品，顯示nomogram與PAAD患者的實際生存期有很好的匹配（圖5B-D）。與傳統(tǒng)的預后評分系統(tǒng)相比巾遭，模型具有更高的AUC值（圖5E）肉康。
????????作者還在訓練組和驗證組中分別對高危組和低危組進行了GSEA富集分析。在訓練集中灼舍，結果顯示吼和，高危組的富集通路包括細胞凋亡、緊密連接骑素、剪接體炫乓、軸突引導和自然殺傷細胞介導的細胞毒性。低風險組的主要富集途徑是神經(jīng)活性配體受體相互作用献丑、味覺轉導末捣、自身免疫性甲狀腺疾病、趨化因子信號通路创橄、局灶粘附（圖S5A）箩做。在驗證組中，結果表明主要的富集途徑包括高風險組中的蛋白酶體妥畏、糖基磷脂酰肌醇GPI錨的生物合成邦邦、核苷酸切除修復安吁、氨基酰tRNA的生物合成和DNA復制，而在低風險組中燃辖，主要的富集途徑是心肌收縮鬼店、長期抑郁癥、血管平滑肌收縮黔龟、鈣信號通路和肌萎縮側索硬化癥ALS（圖S5B）薪韩。
03 - 藥物與免疫分析
????????為了預測化療反應，作者使用pRRophetic算法捌锭，根據(jù)GDSC數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的PAAD患者的半最大抑制濃度（IC50）來估計化療反應俘陷。共有49個小分子化合物在高風險組和低風險組之間有明顯不同的反應。發(fā)現(xiàn)前四個小分子化合物在高危組和低危組之間的P值最低观谦，包括A.443654（圖6A）拉盾，PD.173074（圖6C），Epothilone.B（圖6E）豁状，Lapatinib（圖6G）捉偏。高危組的PAAD患者對A.443654、Epothilone.B和Lapatinib更敏感泻红，而低危組患者對PD.173074更敏感夭禽。然后通過PubChem網(wǎng)站對這4個小分子化合物的三維構象進行了可視化（圖6B、D谊路、F讹躯、H）。鑒于這些發(fā)現(xiàn)缠劝，這些小分子化合物可能是潛在的PAAD治療劑潮梯，但在不久的將來還需要進一步分析。
????????腫瘤微環(huán)境惨恭，包括免疫細胞和基質細胞秉馏，被認為在腫瘤的發(fā)展、轉移脱羡、復發(fā)和耐藥性中起著重要作用萝究。因此，結合免疫評分锉罐、基質評分和ESTIMATE評分帆竹，分析這些評分與風險評分的關聯(lián)。結果顯示風險評分與免疫評分氓鄙、基質評分和ESTIMATE評分（圖7A-C）顯著相關馆揉。使用CIBERSORT算法計算PAAD患者中22種亞型免疫細胞的比例（圖7D），高危組的B細胞記憶抖拦、巨噬細胞M1和肥大細胞靜止期的浸潤水平高于低危組升酣。然而，低風險組的B細胞Naive态罪、T細胞CD8噩茄、單核細胞和肥大細胞激活的浸潤水平高于高風險組（圖7E）。此外复颈，評估了風險評分和五種免疫細胞之間的相關性绩聘。結果表明，T細胞CD8耗啦，單核細胞凿菩，和B細胞Naive與風險評分呈正相關，而巨噬細胞M1和B細胞記憶與風險評分呈負相關帜讲。
04 - GSDMC相關實驗
????????為了研究GSDMC在PAAD細胞中的作用衅谷，設計了兩個siRNA（GSDMC-1, GSDMC-2）來抑制GSDMC在PANC-1和CFPAC-1細胞中的表達。通過Western blot驗證了GSDMC的表達似将，并發(fā)現(xiàn)上述兩個siRNA能有效地敲除GSDMC的表達获黔。Western blot顯示，在PANC-1和CFPAC-1細胞中在验，用siRNA敲除GSDMC玷氏，減少了波形蛋白和Ki-67，但增加了E-cadherin表達（圖8A）腋舌。根據(jù)這些結果盏触，GSDMC可以促進PAAD細胞的增殖和侵襲。為了研究低表達的GSDMC對細胞增殖块饺、侵襲耻陕、遷移的影響。對轉染了Si-GSDMC-1或Si-GSDMC-2的CFPAC-1和PANC-1細胞分別進行了CCK8刨沦、菌落形成試驗诗宣、EdU、Transwell和傷口愈合實驗想诅。CCK8結果顯示召庞，NC組的CFPAC-1細胞在24、48来破、72和96小時的增殖能力明顯強于其他組（圖8B）篮灼。通過腫瘤細胞集落形成實驗，發(fā)現(xiàn)轉染了Si-GSDMC-1或Si-GSDMC-2的CFPAC-1細胞的增殖能力明顯低于NC組（圖8D）徘禁。EdU染色實驗結果顯示诅诱，敲除GSDMC基因對CFPAC-1細胞的增殖影響明顯，轉染Si-GSDMC-1或Si-GSDMC-2的CFPAC-1細胞的增殖能力明顯低于NC組（圖8E）送朱。轉孔實驗結果顯示娘荡，沒有GSDMC干旁，限制了CFPAC-1細胞的遷移和侵襲。傷口愈合實驗的結果顯示炮沐，低表達的CFPAC-1細胞的遷移能力較低争群。該結果與CFPAC-1在PANC-1細胞系中的表現(xiàn)相似（圖8C、F大年、H换薄、I、K）翔试。這些結果表明轻要，敲除GSDMC的表達可以抑制PAAD的細胞增殖、遷移和侵襲垦缅。
????????為了測試細胞增殖和遷移的抑制是否由敲除GSDMC引起冲泥，使用慢病毒系統(tǒng)在PANC-1和CFPAC-1細胞中重新表達GSDMC（圖S8A）。根據(jù)CCK8檢測失都、EdU染色檢測和克隆形成檢測柏蘑，我們發(fā)現(xiàn)，與GSDMC沉默的細胞相比粹庞，GSDMC沉默后的PANC-1和CFPAC-1細胞的細胞增殖和集落形成能力得到了一定程度的恢復（圖S8B-H）咳焚。此外，與GSDMC沉默的細胞相比庞溜，GSDMC沉默后的PANC-1和CFPAC-1細胞的細胞侵襲和遷移也得到了一定程度的拯救（圖S8G-K）革半。
????????為了驗證GSDMC在PAAD中的潛在作用流码，還進行了功能增益或功能喪失的分析又官。首先，在PANC-1和CFPAC-1細胞中過表達GSDMC漫试，Ki-67和vimentin的表達明顯增加六敬，E-cadherin的表達明顯減少，這表明過表達GSDMC可以促進PAAD細胞增殖和侵襲（圖S9A）驾荣。使用CCK8試驗測量細胞活力外构，以確定GSDMC對PAAD細胞增殖的影響。據(jù)觀察播掷，PANC-1和CFPAC-1細胞在轉染GSDMC后审编，其生長曲線都有明顯增加（圖S9B，C）歧匈。與上述CCK8分析結果一致垒酬，GSDMC的過表達比對照組增加了更多的克隆數(shù)（圖S9D，F(xiàn)）。在PANC-1和CFPAC-1細胞中勘究，當GSDMC過表達時都顯示出更高的EdU陽性染色（圖S9E矮湘，H）。這些結果表明乱顾，由于GSDMC的上調板祝，促進了PAAD細胞的增殖宫静。此外走净，在轉孔實驗中，GSDMC的過表達明顯增強了PANC-1和CFPAC-1細胞的侵襲能力（圖S9G孤里，I）伏伯。在傷口愈合實驗中，PANC-1和CFPAC-1細胞的細胞遷移速度都得到了極大的促進（圖S9J捌袜，K）说搅。總之虏等，這些結果表明弄唧，過量表達GSDMC會促進PAAD的細胞增殖、遷移和侵襲霍衫。
05 - A.443654抑制PAAD的細胞增殖
????????為了研究A.443654對PAAD的潛在治療作用候引，作者對PANC-1細胞系進行了CCK8檢測、克隆形成檢測敦跌、EdU染色檢測和細胞周期分析澄干。CCK8試驗表明，用A.443654處理后柠傍，PANC-1細胞的細胞活力呈上升趨勢（圖S10A）麸俘。克隆形成試驗表明惧笛，用A.443654處理后从媚，PANC-1細胞的克隆數(shù)量明顯減少（圖S10B）。EdU結合試驗表明患整，用A.443654處理后拜效，PANC-1細胞的EdU陽性染色降低（圖S10C）。細胞周期分析表明并级，用A.443654處理后拂檩，PAAD的細胞增殖可被抑制（圖S10D，E）嘲碧〉纠總之，這些結果表明，A.443654可以抑制PAAD的細胞增殖望抽。
四加矛、結論
????????在這項研究中，作者建立了一個基于IL18煤篙、CASP4斟览、NLRP1、NLRP2和GSDMC基因的預后模型辑奈，有效預測了PAAD患者的預后苛茂。結果表明，這些基因可以成為預測PAAD患者總體生存的潛在生物標志物鸠窗。此外妓羊，體外實驗的結果顯示，GSDMC可以促進PAAD細胞的增殖稍计、遷移和侵襲躁绸。
