視頻12：甲基化測序
DNA甲基化
定義：
DNA的甲基化是在DNA的序列不變的條件下，在其中某些堿基上加上甲基的這樣一個過程笋庄。
結(jié)果：
一般是使甲基化位點(diǎn)的下游的基因表達(dá)量變少
DNA甲基化測序
原理
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用亞硫酸氫鹽來處理DNA
1
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用堿來處理度帮。結(jié)合了亞硫酸氫根的非甲基化的C均驶，就被脫氨基，并且脫亞硫酸根婴噩。然后骆撇，就被轉(zhuǎn)化成U堿基瞒御。
image.png 再經(jīng)過PCR，PCR新合成出來的鏈神郊，U堿基的位置葵腹，就會被替換成了“T”。
如果它保持是“C”屿岂，就說明這個位置是被甲基化、或者羥甲基化了鲸匿。如果測到的是“T”爷怀，就說明這個位置是沒有被甲基化、或者羥甲基化带欢。
甲基化的建庫過程
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用Illumina公司的Truseq DNA建庫方法
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Illumina Truseq DNA建庫試劑盒當(dāng)中运授，它所提供的接頭，那么這個接頭上的C堿基都是已經(jīng)經(jīng)過甲基化修飾了乔煞。
- 缺點(diǎn)：在用亞硫酸氫鹽處理DNA文庫的時侯吁朦，90%以上的DNA鏈會斷掉。這樣渡贾，已經(jīng)建好的文庫逗宜，其中90%分子會被破壞掉。也就是說文庫的豐富度就會損失90%以上空骚。
- 相應(yīng)的好處：在這個建庫過程當(dāng)中用的PCR循環(huán)數(shù)較少纺讲。所以它PCR擴(kuò)增效率不同，所引起的文庫不均一程度也就較低囤屹。也就是我們通常所說的PCR bias較少熬甚。
EpiCentre公司開發(fā)了EpiGnome方法
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第1步，亞硫酸氫鹽先處理DNA肋坚，把未甲基化的C都轉(zhuǎn)變成U乡括。
image.png 第2步肃廓，把帶標(biāo)簽1的隨機(jī)引物加入，進(jìn)行第一次的復(fù)制诲泌。得到第1條的復(fù)制鏈盲赊。
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第3步，是消化掉過量的引物档礁。
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第4步角钩，是加入帶末端終止堿基、并帶標(biāo)簽2的隨機(jī)引物呻澜。這個引物的作用是讓第1復(fù)制鏈延伸递礼，并且加上標(biāo)簽2。
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image.png 第5步是加入建庫的PCR引物羹幸，進(jìn)行PCR脊髓。通過PCR，把Index序列和成簇引物序列加入到鏈的兩側(cè)栅受。得到真正的文庫将硝。
優(yōu)點(diǎn)：豐富程度會比較高。
缺點(diǎn)：要做較多的PCR循環(huán)屏镊，那么有了比較多的PCR循環(huán)之后依疼，PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增均一性是不太好的。也就是說PCR bias會比較大而芥。
HiSeq2000/2500****測甲基化文庫的問題律罢、和解決方案
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問題：
這個文庫中是嚴(yán)重地缺少C堿基的，也就是四種堿基的比例是嚴(yán)重不平衡的棍丐。這樣在用HiSeq 2000或2500測序儀來測甲基化文庫的過程當(dāng)中误辑，文庫測序得到的數(shù)據(jù)質(zhì)理就較差。并且經(jīng)過PF過濾得到的有效的數(shù)據(jù)產(chǎn)量也會較低歌逢。 -
解決方案：
在上機(jī)過程當(dāng)中巾钉，是摻入大比例的基因組文庫，或者PhiX文庫秘案，來補(bǔ)充比較多的C堿基砰苍，一般會摻30%的PhiX文庫、或者基因組文庫阱高。
羥甲基化測序
難題：
甲基化和差甲化的C堿基都不能被轉(zhuǎn)化成U堿基
兩種辦法
第一種辦法
通過高釕酸鉀（KRuO4）來氧化羥甲基化的C师骗。羥甲基化的C可以被轉(zhuǎn)化成甲酰化的C堿基讨惩，而甲醣侔化的C堿基，是可以被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成U的荐捻。
氧化
可以
效果：
用高釕酸鉀氧化的方法來氧化羥甲基化的C黍少，其轉(zhuǎn)化效率是94%左右寡夹。
第二種區(qū)分羥甲基化C的方法
用糖基把羥甲基化的C給保護(hù)起來。然后用TET蛋白（Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1）厂置，把甲基化的C轉(zhuǎn)化成羥基化的C
效果：
92%的羥甲基化的C得到了糖基的保護(hù)菩掏，還保持了C
數(shù)據(jù)分析
問題：
因?yàn)閬喠蛩釟潲}處理過后，絕大部分的C都被轉(zhuǎn)化成了T昵济。這樣智绸，測出來的序列在和基因組進(jìn)行對比的時侯，直接對比是對比不上的访忿。為了要進(jìn)行比對瞧栗，就要把基因組的堿基做兩種轉(zhuǎn)變。
解決方法：
第一種轉(zhuǎn)變：
把基因組上所有的C都改到T海铆，再來和測序測到的序列來對比迹恐。這樣，就可以把原來的鏈給對比上卧斟。
第二種轉(zhuǎn)變：
把基因組上所有的G都變成A殴边，這樣才能和經(jīng)過PCR得到的原樣本鏈睥互補(bǔ)鏈對比得上。這樣做的原因珍语，是原樣本鏈的互被鏈锤岸，它上面絕大部分的G，都被變成了A板乙。所以是偷，只有把（參考）基因組上的G，也都改成A亡驰，這樣才能對比得上。比對上之后饿幅，再來看哪些堿基是沒有被轉(zhuǎn)化的凡辱。這樣，就可以確認(rèn)這些堿基的甲基化修飾情況了栗恩。
設(shè)置內(nèi)參
問題：
亞硫酸氫鹽對未甲基化的C的轉(zhuǎn)化效率并不是100%透乾，一般是在99%左右。
方案一：
轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)當(dāng)中加入內(nèi)參對照品磕秤。一般情況下乳乌，是用甲基化酶缺陷型的大腸桿菌，所生產(chǎn)出來的完全沒有被甲基化的λ（噬菌體）DNA市咆，或者pUC19（質(zhì)粒）DNA做內(nèi)參汉操。來看一次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中C的轉(zhuǎn)化效率。一般情況下蒙兰，實(shí)驗(yàn)當(dāng)中是加入1%的完全沒有甲基化的λ DNA做內(nèi)參磷瘤。
方案二：
通過用甲基化酶處理過的芒篷，CpG島完全被甲基化的DNA，來跟蹤甲基化DNA對亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的抵抗效果采缚。
這個方向停止更新20200413
因?yàn)閷τ诂F(xiàn)階段的我?guī)椭皇呛艽笳肼€有很多重要的事情去做，除非以后有閑暇時間再來續(xù)更扳抽。資料都是借鑒了很多其他人的資料篡帕。
