先導(dǎo)編輯器（Prime E）的遞送和優(yōu)化由于其較大的尺寸和復(fù)雜受到了限制。盡管分離式的基因組編輯工具可以縮小結(jié)構(gòu)的大小糟描，但它們需要特殊的手段將結(jié)合和催化結(jié)構(gòu)域連接在一起菇晃。
該文章報道了一種分離式PE（sPE），其中Cas9切口酶（nCas9）與逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）保持分離蚓挤。sPE在精確編輯方面顯示出與初始未拆分PE3相似的效率磺送，并且插入-刪除（indel）的副產(chǎn)物沒有增加驻子。通過將sPE注射遞送到小鼠肝臟以修飾β-catenin，驅(qū)動腫瘤形成的效率與PE3類似估灿。用兩種腺相關(guān)病毒（AAV）載體糾正了I型酪氨酸血癥模型小鼠的致病突變崇呵。類似地，先導(dǎo)編輯引導(dǎo)RNA（pegRNA）可以拆分為單個引導(dǎo)RNA（sgRNA）和環(huán)狀RNA RT模板馅袁，增加了sPE系統(tǒng)的靈活性和穩(wěn)定性域慷。
傳統(tǒng)的PE2系統(tǒng)，其大小超出了AAV的包裝容量汗销。實驗者將PE2的nCas9蛋白和RT酶拆分為兩部分進(jìn)行分別表達(dá)犹褒。那么，如何將分離式的nCas9蛋白與RT酶偶聯(lián)在一起弛针？實驗者設(shè)計了MCP（MS2外殼蛋白）與MS2叠骑，scFv單鏈抗體兩種方式。
如上圖所示削茁，首先是MCP-MS2宙枷，實驗者將MCP與分離式的RT融合表達(dá)，再在nCas9 RNP tracrRNA上添加一個MS2序列茧跋，添加位置位于不同的loop結(jié)構(gòu)上及末端慰丛，pegRNA2.0和pegRNA1.0-2×MS2則添加了2個MS2序列。
第二種方法則是SunTag scFv系統(tǒng)瘾杭，實驗者將GCN4與nCas9的N端和C端分別融合表達(dá)诅病，RT酶則掛載scFv單鏈抗體，以實現(xiàn)RT與nCas9的偶聯(lián)粥烁。
實驗者通過轉(zhuǎn)換過早終止的密碼子表達(dá)mCherry測試上述Split PE贤笆、SunTag-PE3和MS2-PE3系統(tǒng)的編輯效率。RTT為pegRNA的RT模板页徐，PBS為prime binding site。
通過測試實驗者發(fā)現(xiàn)银萍，MS2-PE3編輯效率最高的為nCas9+MCP-RT+pegRNA1.1变勇，而SunTag-PE3編輯效率較高的為N端融合SunTag的系統(tǒng)贴唇，但其編輯效率低于傳統(tǒng)PE3搀绣。因此實驗者后續(xù)的MS2-PE都使用nCas9+MCP-RT+pegRNA1.1系統(tǒng)，SunTag-PE使用N端融合SunTag的系統(tǒng)戳气，未添加任何偶聯(lián)原件的系統(tǒng)sPE作為對照組链患。
通過測試實驗者意外的發(fā)現(xiàn)sPE的編輯效率與MS2-PE3相當(dāng)，比SunTag-PE3高瓶您，且與傳統(tǒng)PE3編輯效率相當(dāng)麻捻。
實驗者又通過在HEK293T細(xì)胞的HEK3位點安裝“CTT”纲仍，對PE3、Split PE贸毕、SunTag-PE3和MS2-PE3進(jìn)行Sanger測序和EditR定量郑叠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Split PE效果大于SunTag-PE3和MS2-PE3。
進(jìn)一步檢測較大刪除或者插入效率明棍，引入紅綠熒光報告模型乡革，該模型是一個39bp到18bp的替換和47bp的刪除。
使用紅綠熒光報告模型細(xì)胞摊腋，MS2-PE3和Suntag-PE3的表現(xiàn)差強人意沸版。
實驗者在更多的基因位點上測試了MS2-PE3和Suntag-PE3，總體的編輯效果低于PE3兴蒸。因此試圖在sPE3上進(jìn)一步優(yōu)化视粮。
在對sPE系統(tǒng)優(yōu)化的嘗試中，實驗者首先更換了另外兩種RT酶——E.r.matuase RT和Gsl-IIC RT类咧，以測試其編輯效率馒铃。結(jié)果表明E.r.matuase RT和Gsl-IIC RT作為原件的sPE系統(tǒng)編輯可以成功發(fā)生編輯，但效率低于MLV RT痕惋。
實驗者又構(gòu)建了dCAS9区宇，也就是熟悉的Cas9D10A+H840A和RTΔYVDD，在FANCF基因座上進(jìn)行3-nt的堿基替換值戳。結(jié)果表明议谷，切口酶nCas9H840A對于sPE系統(tǒng)是不可或缺的。
動物實驗中堕虹，實驗者使用sPE刪除Ctnnb1（β-catenin）中S45的密碼子卧晓，通過尾靜脈注射促使成年FVB小鼠形成腫瘤。
注射后四周赴捞，PE3系統(tǒng)平均每只小鼠產(chǎn)生9.75±2.5個腫瘤（n=4）逼裆，而sPE誘導(dǎo)每只小鼠12.2±3.3個腫瘤（n=5）。IHC染色證實了肝腫瘤中β-catenin的致癌突變激活赦政，擴增子深度測序證實了PE3-和sPE處理組中Ctnnb1中精確的3-bp缺失胜宇。表明sPE能夠在體內(nèi)進(jìn)行精確高效的編輯。
實驗者將sPE包裝成AAV注射入富馬酸乙酰乙酸水解酶（Fah）的功能缺失（G＞A）突變引起的I型酪氨酸血癥模型小鼠恢着。Fah是酪氨酸分解代謝途徑的關(guān)鍵酶桐愉，其缺失會導(dǎo)致肝細(xì)胞毒素積聚和肝損傷。Fah突變小鼠需要持續(xù)補充2-1,3-環(huán)己烷二酮（NTBC）掰派，以防止體重減輕从诲。
在Fah突變小鼠中，靜脈注射雙AAV成功阻止了體重減輕靡羡。NTBC停藥后24天處死的小鼠肝細(xì)胞Fah基因座通過深度測序進(jìn)行精確編輯確認(rèn)系洛。這種遞送方法的編輯效率相對較低（1.3%）俊性，有待于進(jìn)一步的pegRNA和nick sgRNA優(yōu)化。
作者認(rèn)為既然nCas9和RT可以分離碎罚，那pegRNA是否可以繼續(xù)拆分磅废？因此，產(chǎn)生上圖的思路荆烈。RTT+PBS加MS2的適體拯勉，可以偶聯(lián)到MCP-RT上去。使用核酶+RtcB環(huán)化RTT+PBS憔购，以增加其豐度宫峦。
根據(jù)MS2添加的位置不同，分為petRNA和petRNA-3’玫鸟。后續(xù)的測試表明petRNA的編輯效果更好导绷。
沒有MCP和MS2適配體的分離式pegRNA的編輯水平，均低于pegRNA屎飘。所以妥曲，如果想使用分離式pegRNA，一定要添加適配體钦购。
Northern印跡顯示pegRNA和petRNA的完整性和豐度檐盟。這些數(shù)據(jù)表明，環(huán)狀的petRNA在RNA完整性和豐度方面優(yōu)于pegRNA押桃，這對sPE編輯效率和保真度都至關(guān)重要葵萎。
實驗者還更換了不同的Cas9進(jìn)行測試，上圖中spCas9和sauCAS9共用一個切口位置唱凯，均得到了相當(dāng)?shù)木庉嬓省?/p>
該結(jié)果表明羡忘，可以使用替代的切口酶，同時得到令人滿意的編輯效率磕昼。同源nCas9或非CRISPR–Cas模塊的潛在用途可能會將系統(tǒng)PAM為NGG的限制中解放出來卷雕，并為PE編輯的設(shè)計提供更多靈活性。
最后票从，實驗者將sPE和PE2系統(tǒng)中的Cas9切口酶和RT反轉(zhuǎn)錄酶全部使用IVT-RNA的方式漫雕，遞送至細(xì)胞進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)全部使用RNA的sPE系統(tǒng)和PE3系統(tǒng)都能夠產(chǎn)生精確的編輯結(jié)果纫骑。而使用體外孵育的RNP（ribo-nucleo protein）也可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生精確的編輯蝎亚。
總之九孩，該文章為我們展示出PE3可分離式編輯系統(tǒng)的強大的靈活性先馆，無論是蛋白還是RNA都可以進(jìn)行分離且得到精確的編輯結(jié)果。分離式的最大好處就是能夠進(jìn)一步減少相關(guān)蛋白的包裝尺寸和遞送效率躺彬。另外煤墙，分離的各部分蛋白原件梅惯，無論是使用表達(dá)蛋白的質(zhì)粒DNA，還是中間產(chǎn)物RNA仿野，都具有較好的編輯效率铣减。pegRNA的進(jìn)一步拆分也為我們設(shè)計PE3編輯系統(tǒng)提供了一個新的思路。
