問題
怎么去doublet选侨？挑選出某一大類做小類降維聚類的時候，有人仍然會檢查一下各種大類marker的表達情況然走，這一步是否有必要援制？
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最有效的方法還是從上游入手，控制細胞數(shù)以及優(yōu)化測序之前的流程芍瑞。
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不過分析數(shù)據(jù)的人只能從分析的角度來看了晨仑。
一般我會先用軟件預(yù)測，可以參考我之前寫的一篇帖子：單細胞分析實錄(4): doublet檢測拆檬。
這里引出一個問題洪己，去doublet是在哪一步進行：
- 跑完cellranger得到矩陣，去doublet竟贯，基本QC(基因數(shù)答捕、UMI數(shù)等等)...
- 跑完cellranger得到矩陣，基本QC(基因數(shù)屑那、UMI數(shù)等等)拱镐，去doublet...
兩種應(yīng)該差別不大。我一般是第一種持际，考慮到基本QC可能會來回換幾次閾值沃琅，所以基本QC這一步應(yīng)該相對靠后，省得再跑doublet這一步
軟件一般我會用多個选酗，兩個軟件同時報告為doublet的cellular barcode阵难，我會挑出來去掉。
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除此之外芒填，我還會用一些經(jīng)典的marker來找doublet呜叫。（這種方法也能用來注釋細胞）
celltype_marker=c(
"Epcam",#上皮細胞 epithelial
"Pecam1","Cdh5",#內(nèi)皮細胞 endothelial
"Pdgfra","Col1a1","Col3a1",#成纖維細胞 fibroblasts
"Fcgr1","Cd163","Aif1","Cd68",#髓系細胞 myeloid
"Ms4a1",#B細胞
"Cd3g","Cd3e",#T細胞
"Ncr1",#NK細胞
"Ptprc"#免疫細胞
)
VlnPlot(allseu,features = celltype_marker,pt.size = 0,ncol = 2)
類似這樣空繁，如果某群cluster表達了不太可能同時出現(xiàn)的gene，則有可能是doublet朱庆。當(dāng)然也要憑借一些經(jīng)驗盛泡，比如成纖維的marker可能在內(nèi)皮細胞中有一定程度的表達，CD4(一個基因)可能在髓系細胞中有一定程度的表達娱颊，這是可能的傲诵。但T細胞高表達EPCAM，我是不相信的箱硕。
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還有一個經(jīng)驗之談：用marker鑒定doublet的時候拴竹，被鑒定出來的doublet(這是前提)，可能單獨聚出來成為一個小團剧罩，也有可能看上去像是連接某兩個亞群的橋梁栓拜。
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另外，上述都是針對大類clustering的描述惠昔，做小類的reclustering的時候幕与，我一般不考慮去小類之間的doublet，一是因為很難區(qū)分镇防，二是小類之間的doublet形成概率比大類doublet形成概率低很多啦鸣。
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還有一種情況(比較少見)，是樣本之間的doublet来氧。這時诫给，利用SNP可以比較精確地區(qū)分出sample1, sample2, 以及doublet(sample1+sample2)。
目前已經(jīng)有一些工具可以從scRNA-seq數(shù)據(jù)中獲取少量SNP信息啦扬，并達到上述目的蝙搔，比如Souporcell(原文https://www.nature.com/articles/s41592-020-0820-1)，準確性還可以考传。
但多數(shù)情況還是一個樣本一測吃型，這種思路可行性不大。
回到第2個小問題
挑選出某一大類做小類降維聚類的時候僚楞，有人仍然會檢查一下各種大類marker的表達情況勤晚，這一步是否有必要？
很有必要泉褐。在做reclustering這一步的時候赐写，檢查大類marker的表達，我經(jīng)常會看到其他大類細胞(或者是這類細胞與其他大類細胞組成的doublet)亂入膜赃。之前沒做過這一步的朋友挺邀，可以試試，會有驚喜(嚇)。
這時最嚴謹?shù)淖龇ㄊ前褋y入的其他大類細胞放回它應(yīng)該去的地方，單細胞聚類注釋就是一個“分分合合”的過程，也是最耗時最繁瑣的過程测蹲。
如果數(shù)量不多畸肆，直接去掉鸟悴，影響也不大。
如果是這類細胞與其他大類細胞組成的doublet，直接去掉。
