使用細(xì)胞熱移位測定法鑒定嘌呤核苷磷酸化酶作為奎寧的靶標(biāo)
文獻(xiàn)導(dǎo)讀
細(xì)胞熱轉(zhuǎn)變分析實(shí)驗(yàn)（CETSA）最初是為了幫助抗癌藥物靶向研究而開發(fā)出來的方法沐飘，它是第一種廣泛應(yīng)用無標(biāo)簽方法來研究藥物靶向完整細(xì)胞的方法饮寞。
這項(xiàng)技術(shù)是根據(jù)熱展開蛋白在細(xì)胞中迅速沉淀后通過監(jiān)測heat challenge后剩余的可溶性蛋白來測量融化曲線的。這與使用純化蛋白的經(jīng)典熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)類似磷斧，配體結(jié)合通常導(dǎo)致蛋白穩(wěn)定和熔融溫度（tm）的正向轉(zhuǎn)移。將CETSA與多路定量質(zhì)譜連用（MS-CETSA）可以同時(shí)監(jiān)測整個(gè)蛋白組在藥物治療過程中蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的變化。這樣就可以在MS-CETSA中識(shí)別與藥物互相作用的蛋白質(zhì)，而不需要事先了解相關(guān)的通路或機(jī)制耿导，在這項(xiàng)研究中，作者為用MS-CETSA來研究惡性瘧原蟲開發(fā)了一種有效的方法态贤，并且將其應(yīng)用于抗瘧藥物靶點(diǎn)的識(shí)別上舱呻。隨后，作者用這種方法鑒定出惡性瘧原蟲嘌呤核苷磷酸化酶（PfPNP）為奎寧和甲氟喹的蛋白靶點(diǎn)悠汽。作者還運(yùn)用了酶學(xué)和生物物理的體外實(shí)驗(yàn)箱吕，觀察到了奎寧和PfPNP的高親和力。得出了其起藥物的MoAs中的作用柿冲。
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文獻(xiàn)摘要
對(duì)于臨床上使用的大多數(shù)抗瘧藥物茬高，我們對(duì)其機(jī)制（MoAs）一直難以捉摸。為了減少對(duì)抗瘧治療的反應(yīng)性假抄，我們有必要去更好的理解他們的作用機(jī)理（MoAs）和相關(guān)耐藥性機(jī)制怎栽。在本研究中丽猬，作者采用的細(xì)胞熱轉(zhuǎn)變分析（CETSA）結(jié)合質(zhì)譜法（MS）對(duì)人瘧疾的主要致病原惡性瘧原蟲進(jìn)行了藥物靶向鑒定。驗(yàn)證結(jié)果是該方法對(duì)葉酸拮抗性乙胺嘧啶和廣譜半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64d的有效性婚瓜。隨后宝鼓，作者將MS-CETSA應(yīng)用于兩種重要的抗瘧藥物奎寧和甲氟喹，發(fā)現(xiàn)這兩種藥物的MoAs特征不明顯巴刻。之后作者又結(jié)合了對(duì)P惡性瘧原蟲裂溶液和完整感染紅細(xì)胞的研究愚铡，發(fā)現(xiàn)P惡性瘧原蟲嘌呤核苷磷酸化酶（PfPNP)是這兩種 這兩種喹啉類藥物的共同結(jié)合靶點(diǎn)。之后作者再一次利用重組蛋白進(jìn)行了生物物理和結(jié)構(gòu)相關(guān)研究胡陪，證實(shí)了這兩種化合物都結(jié)合在酶的活性位點(diǎn)上沥寥。由于奎寧與PfPNP具有較低的納米分子親和力；因此其治療效果很明顯柠座∫匮牛總之，作者證明了對(duì)惡性瘧原蟲實(shí)施MS-CETSA是闡明現(xiàn)有的和潛在抗瘧藥物的MoAs的一項(xiàng)有希望的方法妈经。
文獻(xiàn)背景
瘧疾是由熱帶和亞熱帶地區(qū)瘧原蟲屬原生生物引起的流行傳播疾病淮野。在過去的十年中大家通過持續(xù)不斷的努力去根除瘧疾使得全球負(fù)擔(dān)和死亡率大大的減少了。然而, 瘧疾仍然是一個(gè)重大的健康問題吹泡，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的估計(jì)骤星，僅在2016年便有2.16億瘧疾患者和44500例死亡患者。最近在瘧疾控制方面取得的成功主要是有效的控制了媒介和采用了青蒿素聯(lián)合療法爆哑。然而洞难，蚊子對(duì)常用殺蟲劑的耐藥性的增加和瘧原蟲對(duì)標(biāo)準(zhǔn)ACTs的反應(yīng)性降低可能會(huì)使瘧疾發(fā)病率在不久的將來大幅度的升高。
絕大多數(shù)用于臨床上的抗瘧藥物并沒有合理設(shè)計(jì)來干擾特定的分子靶點(diǎn)揭朝，而是根據(jù)它們?cè)诒硇秃Y選中的強(qiáng)大抗瘧特性進(jìn)行鑒定的队贱。因此對(duì)其作用機(jī)制（MoAs）的了解在大多數(shù)情況下仍處于初級(jí)階段。在所有現(xiàn)有的抗瘧藥物中潭袱，除了青蒿素之外柱嫌，喹諾寧是臨床中使用最廣的一類藥物奎寧，甲氟喹以及氯喹直到今天還被廣泛地運(yùn)用于臨床屯换。盡管氯喹的抗瘧作用似乎與抑制寄生蟲消化液泡中的紅素解毒密切相關(guān)慎式，但是其他喹啉類藥物的作用機(jī)制仍然不清楚。
現(xiàn)今趟径，甲氟喹是ACT配方中的關(guān)鍵的藥物，特別是在東南亞使用的甲氟喹仍然是瘧疾的重要化學(xué)預(yù)防劑癣防。上個(gè)世紀(jì)80年代蜗巧，東南亞報(bào)道了兩種藥物的耐藥性，并且其耐藥性與pfmdr1基因復(fù)制的增加有關(guān)蕾盯。pfdr1編碼一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pfpGH1, 該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被認(rèn)為有介導(dǎo)藥物從細(xì)胞質(zhì)流入到消化液泡作用幕屹。這表明甲氟喹/奎寧的分子靶點(diǎn)存在于細(xì)胞溶膠中，因此兩種藥物的MOSA（至少一部分）與氯喹不同。與此一致的是望拖，最近的研究表明渺尘，甲氟喹通過與80S核糖體結(jié)合來抑制轉(zhuǎn)錄，但是到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)奎寧的具體靶點(diǎn)说敏。
結(jié)果分析
CETSA對(duì)惡性瘧原蟲的適應(yīng)性
在這項(xiàng)研究中鸥跟，作者實(shí)施并驗(yàn)證了用MS-CETSA來鑒定惡性瘧原蟲蛋白質(zhì)組中抗瘧藥物的直接蛋白質(zhì)靶標(biāo)。作者使用體外血液階段惡性瘧原蟲寄生蟲的細(xì)胞裂解物來研究直接藥物-靶標(biāo)相互作用（“裂解物”）盔沫。此外医咨，作者還使用了完整的惡性瘧原蟲感染的紅細(xì)胞來研究藥物-靶標(biāo)參與和隨后的細(xì)胞環(huán)境中的下游效應(yīng)（“完整細(xì)胞”）。由于紅細(xì)胞（RBC）細(xì)胞質(zhì)中高豐度的血紅蛋白和碳酸酐酶-1架诞，他們會(huì)影響MS分析拟淮，所以對(duì)于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，作者使用了惡性瘧原蟲感染的磁性富集紅細(xì)胞來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)谴忧『懿矗總的來說，作者采用了兩種現(xiàn)有的CETSA數(shù)據(jù)收集策略變體（圖1）:( i）熔解曲線CETSA方法沾谓，其中在存在或不存在藥物的情況下在10個(gè)不同溫度下監(jiān)測蛋白質(zhì)沉淀; （ii）等溫劑量反應(yīng)（ITDR）CETSA委造，即在單一溫度下用多種藥物濃度監(jiān)測蛋白質(zhì)穩(wěn)定化。裂解物和細(xì)胞內(nèi)CETSA數(shù)據(jù)集的交叉參考提供了辨別直接和間接藥物作用的途徑之一搏屑。
為了首先評(píng)估惡性瘧原蟲蛋白質(zhì)組在滋養(yǎng)體階段的融化特性争涌，作者對(duì)未經(jīng)處理的裂解物和完整細(xì)胞樣品進(jìn)行熔解曲線CETSA分析，確定蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)蛋白質(zhì)在37°C至73°C溫度范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性（圖2A）辣恋。因此亮垫，作者計(jì)算了每個(gè)數(shù)據(jù)集中單個(gè)蛋白質(zhì)熔解溫度（Tm;相當(dāng)于50％蛋白質(zhì)變性）的分布（圖2B）。得出的結(jié)果是從裂解物實(shí)驗(yàn)中分離的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出明顯更高的整體熱穩(wěn)定性伟骨。特別地饮潦，在裂解物中存在顯著更高比例的熱穩(wěn)定蛋白（44％）。因此携狭，為了進(jìn)一步分析继蜡，作者采用了更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。作為這些嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果顯示逛腿，完整細(xì)胞中的平均蛋白穩(wěn)定性略低（ΔTm= 0.3°C）稀并。這與對(duì)人類永生化髓性白血病（K562）細(xì)胞進(jìn)行的類似比較一致单默。作者還觀察到兩種熔解曲線實(shí)驗(yàn)變體中的許多大蛋白復(fù)合物的相關(guān)沉淀（圖S1）碘举，這與最近在人類細(xì)胞中描述的熱鄰近共凝集的概念一致（26）。在這里搁廓，作者發(fā)現(xiàn)RBC蛋白中的全局Tm分布通常高于惡性瘧原蟲或K562細(xì)胞蛋白質(zhì)組（圖S2）引颈。
基于CETSA的方法用于鑒定惡性瘧原蟲中的蛋白質(zhì)藥物靶標(biāo)
為了鑒定惡性瘧原蟲中的藥物 - 靶標(biāo)相互作用耕皮，作者采用了CETSA方案的ITDR變體，使用從熔解曲線實(shí)驗(yàn)獲得的信息（圖2）蝙场。相對(duì)于非變性條件凌停，ITDR中的靶蛋白參與被認(rèn)為是響應(yīng)于在單一溫度下藥物濃度增加的蛋白質(zhì)穩(wěn)定化（參見圖1和材料和方法）。使用mineCETSA（一種內(nèi)部開發(fā)的R包）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析售滤，縮放和藥物 - 靶標(biāo)相互作用的鑒定（參見材料和方法）罚拟。
在缺乏關(guān)于藥物的假定靶標(biāo)的身份的先驗(yàn)知識(shí)的情況下，作者選擇ITDR分析的熱挑戰(zhàn)溫度趴泌，使得全局蛋白質(zhì)組被充分取樣舟舒。因此，對(duì)于隨后的ITDR分析嗜憔，作者選擇對(duì)應(yīng)于惡性瘧原蟲蛋白質(zhì)組的平均Tm的51℃和57℃以解釋在完整細(xì)胞樣品中觀察到的蛋白質(zhì)組的更熱穩(wěn)定部分（圖2B）秃励。為了驗(yàn)證完整細(xì)胞CETSA中的這種策略，作者研究了E64d的蛋白質(zhì)靶標(biāo)參與吉捶，E64d是一種廣譜半胱氨酸蛋白酶抑制劑夺鲜，已知與惡性瘧原蟲蛋白質(zhì)組中的幾種靶標(biāo)相互作用。得出的結(jié)果表明CETSA具有以高度特異性檢測瘧疾寄生蟲蛋白質(zhì)組中直接藥物 - 靶標(biāo)結(jié)合的能力呐舔。
基于CESTA的惡性瘧原蟲甲氟喹和奎寧分子靶標(biāo)的鑒定
接下來币励，作者進(jìn)行了ITDR分析，以確定奎寧和甲氟喹的蛋白質(zhì)靶標(biāo)珊拼。對(duì)暴露于奎寧（0至10μM）或甲氟喹（0至100μM）的裂解物樣品應(yīng)用ITDR（51°C）方案食呻，作者發(fā)現(xiàn)嘌呤核苷磷酸化酶（PfPNP; PF3D7_0513300）是唯一表現(xiàn)出高可信度穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中同時(shí)檢測到2157和2032個(gè)惡性瘧原蟲蛋白質(zhì)（圖4澎现，A至D）仅胞。在用甲氟喹進(jìn)行的兩個(gè)相應(yīng)的完整細(xì)胞ITDR中未觀察到PfPNP的穩(wěn)定化，這揭示了三種其他蛋白質(zhì)的劑量依賴性穩(wěn)定化剑辫。丙酮酸激酶II（PfPyKII; PF3D7_1037100）在完整細(xì)胞ITDR（57℃）中表現(xiàn)出早期劑量依賴性穩(wěn)定化（MDT干旧，~19.5nM）。然而妹蔽，這伴隨著37℃下蛋白質(zhì)豐度的增加椎眯，表明穩(wěn)定化可能反映了藥物結(jié)合的下游效應(yīng)，也導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平增加胳岂”嗾考慮到PfPyKII對(duì)于寄生蟲的代謝至關(guān)重要，參考條件下蛋白質(zhì)豐度的變化可能代表對(duì)藥物引起的擾動(dòng)的一般應(yīng)激反應(yīng)乳丰。在完整細(xì)胞ITDR（57℃）中也觀察到兩種線粒體蛋白熱休克蛋白70（Hsp70-3; PF3D7_1134000）和GrpE蛋白同源物（Mge1; PF3D7_1124700）的穩(wěn)定化闹击，但僅在最高藥物劑量下可檢測到（10μM）（圖S4）。這可能反映了由惡性瘧原蟲細(xì)胞中甲氟喹誘導(dǎo)的反應(yīng)性氧化物種（ROS）對(duì)線粒體膜的間接影響成艘。盡管甲氟喹具有更廣譜的惡性瘧原蟲蛋白（包括PfPNP）赏半，但在MS-CETSA中，奎寧似乎幾乎完全參與PfPNP淆两。使用Western印跡進(jìn)一步驗(yàn)證断箫，直接再現(xiàn)觀察到的PfPNP穩(wěn)定性的變化（圖S5）。因此可以想象秋冰，PfPNP不僅在奎寧的MoA中起主要作用仲义，而且還可以促成甲氟喹的MoA。我們還在完整細(xì)胞ITDR實(shí)驗(yàn)中觀察到響應(yīng)奎寧（MDT剑勾，0.15μM）的人線粒體60-kDa熱休克蛋白（HSPD1; P10809）的穩(wěn)定化（圖S6）埃撵。目前，關(guān)于宿主蛋白在寄生蟲生長和/或其在藥物MoAs中的作用的作用知之甚少虽另。盡管如此暂刘，這些結(jié)果可能表明它們的生物學(xué)相關(guān)性。
奎寧和甲氟喹與PfPNP結(jié)合的體外驗(yàn)證
為了進(jìn)一步評(píng)估PfPNP與奎寧和甲氟喹的相互作用频丘，作者使用異源表達(dá)的重組PfPNP在體外研究了結(jié)合特性腌巾。首先撬讽，我們使用差示掃描熒光測定法（DSF）監(jiān)測奎寧和甲氟喹對(duì)PfPNP的相對(duì)穩(wěn)定作用（圖5A）∩總體而言，DSF證明ImmH仪缸，奎寧贵涵，甲氟喹和奎尼丁具有劑量依賴性穩(wěn)定作用。為了補(bǔ)充DSF分析恰画，我們使用表面等離子體共振（SPR）研究了奎寧和甲氟喹與重組PfPNP的親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)（圖5宾茂，B和C）。使用單輪和多輪穩(wěn)態(tài)或動(dòng)力學(xué)擬合實(shí)驗(yàn)測量三種化合物的結(jié)合和解離速率（表S2）锣尉。如所預(yù)期的刻炒，ImmH顯示出對(duì)PfPNP的緊密結(jié)合和非常慢的解離速率，平衡常數(shù)（KD）為約250pM自沧。喹啉對(duì)PfPNP的親和力較低坟奥。最后，作者通過等溫滴定量熱法（ITC）驗(yàn)證了觀察到的PfPNP與奎寧和甲氟喹的結(jié)合拇厢。 ITC結(jié)果也與SPR結(jié)果非常一致爱谁，顯示出對(duì)奎寧（KD = 65 nM）和甲氟喹（KD =11μM）的相似結(jié)合親和力（圖S7和表S3）。
接下來孝偎，作者使用體外酶測定法访敌，監(jiān)測PfPNP催化的肌苷向次黃嘌呤的轉(zhuǎn)化，以研究奎寧和甲氟喹對(duì)PfPNP的抑制作用衣盾。兩種藥物均阻斷PfPNP酶活性寺旺。然而爷抓，這些值與SPR和ITC的親和力相關(guān)，表明奎寧和甲氟喹都與PfPNP相互作用阻塑，盡管親和力低于ImmH蓝撇。在兩種抗瘧疾化合物中，奎寧對(duì)PfPNP具有始終較高的親和力并且增加了抑制活性陈莽，這也反映在最初的ITDR CETSA測量中渤昌。因此，PfPNP的抑制可能與奎寧的MoA相關(guān)走搁，而PfPNP與甲氟喹相互作用的臨床相關(guān)性可能不太相關(guān)独柑。為了檢驗(yàn)這種可能性，作者在體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲中評(píng)估了兩種藥物與ImmH組合的抗瘧活性私植。作者使用等效線圖分析忌栅，用于揭示藥物對(duì)之間的協(xié)同和/或拮抗作用。在組裝的等效線圖中兵琳，與ImmH組合時(shí)狂秘，兩種喹啉均誘導(dǎo)了較低的殺滅效果（奎寧，ΣFIC50≤1.43;甲氟喹躯肌，ΣFIC50≤1.70）者春。在所測試的藥物比例中可以觀察到兩種異構(gòu)體的顯著偏差，這表明藥物拮抗作用清女。相比之下钱烟，ImmH與E64d組合的等效線圖預(yù)計(jì)不會(huì)與PfPNP相互作用，顯示出與線性函數(shù)的偏差幅度明顯較低（平均值ΣFIC50= 1.09）嫡丙，表明加性獨(dú)立活動(dòng)拴袭。因?yàn)镻fPNP是ImmH和兩種喹啉藥物中唯一已知的共同靶標(biāo)，所以觀察到的拮抗作用可能是由于與PfPNP活性位點(diǎn)結(jié)合的競爭引起的曙博。
甲氟喹和奎寧的晶體結(jié)構(gòu)與PfPNP結(jié)合
為了進(jìn)一步闡明PfPNP的抑制模式拥刻，作者分別用1.66和2.30?的分辨率確定了蛋白質(zhì)與奎寧和甲氟喹的共晶結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示兩種化合物都結(jié)合在PfPNP的活性位點(diǎn)袋中（圖6父泳，A和B）般哼，這與它們對(duì)酶活性的有效抑制一致。在共結(jié)晶的PfPNP-奎寧和PfPNP-甲氟喹配合物中觀察到的PfPNP折疊高度相似惠窄，這表明兩種結(jié)構(gòu)之間原子定位的低度可變性[即蒸眠，Cα原子的均方根偏差（RMSD）為0.2一個(gè)]。整體結(jié)構(gòu)也與先前測定的PfPNP-肌苷（RMSD杆融，0.34 /0.41）和PfPNP-ImmH·SO 4（RMSD楞卡，0.24 /0.28）的復(fù)合物非常相似（圖S8）。
討論回顧
瘧原蟲寄生蟲的特征在于結(jié)合了動(dòng)物和植物樣特征的獨(dú)特生物學(xué)，因此與其他真核系統(tǒng)相比仍然知之甚少蒋腮。因此淘捡，為研究其他真核系統(tǒng)中的藥物活動(dòng)而開發(fā)的研究工具已被用于研究這些原生動(dòng)物，但效果有限池摧。因此案淋，即使對(duì)于臨床使用已有數(shù)十年的化合物，我們對(duì)絕大多數(shù)抗瘧藥物的MoAs的理解仍然不完整险绘。在這里，作者探索了CETSA方法誉碴，用于直接在惡性瘧原蟲細(xì)胞中鑒定抗瘧疾化合物的蛋白質(zhì)靶標(biāo)宦棺。
奎寧和甲氟喹似乎具有重疊的MoAs，兩種藥物的MoAs似乎同時(shí)涉及幾種生物過程的破壞黔帕，但對(duì)于奎寧代咸，先前未發(fā)現(xiàn)直接的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。相反成黄，最近提出了甲氟喹與80S核糖體的直接相互作用呐芥，導(dǎo)致寄生蟲蛋白質(zhì)合成的減弱。在這里奋岁，作者顯示奎寧和甲氟喹與瘧原蟲細(xì)胞中的PfPNP相互作用思瘟，并且兩種藥物都具有抑制PfPNP酶活性的能力。雖然奎寧和甲氟喹在最初的基于裂解物的CETSA中表現(xiàn)出與PfPNP相當(dāng)?shù)臒岱€(wěn)定性（奎寧的MDT--0.1μM和甲氟喹的約0.6μM）闻伶，但在后續(xù)研究中滨攻，奎寧表現(xiàn)出高達(dá)三個(gè)數(shù)量級(jí)的親和力。對(duì)這種酶蓝翰，奎寧能夠以結(jié)合常數(shù)Ki~140nM抑制PfPNP酶活性光绕，這表明其作為臨床相關(guān)活性的潛力。
在奎寧和甲氟喹與ImmH的細(xì)胞毒性作用之間觀察到的拮抗相互作用支持了PfPNP抑制有助于其抗瘧活性的觀點(diǎn)畜份。然而诞帐，雖然immucillins通過同時(shí)抑制宿主和寄生蟲PNP酶發(fā)揮其抗瘧作用，但我們沒有發(fā)現(xiàn)奎寧和甲氟喹與人PNP相互作用的證據(jù)爆雹。
鑒于新出現(xiàn)的青蒿素抗性停蕉，對(duì)瘧疾的新療法的需求變得尤為迫切。通過公共和私營部門的共同努力進(jìn)行的高通量表型篩選測試了數(shù)百萬種化合物顶别，這些化合物對(duì)惡性瘧原蟲的不同發(fā)育階段產(chǎn)生了數(shù)萬個(gè)活性<1μM的分子谷徙。剩下的主要挑戰(zhàn)之一是確定最有效化合物的內(nèi)在分子靶標(biāo)，同時(shí)優(yōu)先考慮新的化學(xué)型驯绎。過去幾年為惡性瘧原蟲開發(fā)的新技術(shù)提高了我們識(shí)別和驗(yàn)證候選藥物目標(biāo)的能力完慧。然而，MS-CETSA與用于藥物靶標(biāo)識(shí)別的現(xiàn)有工具相比具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)剩失。其在大部分寄生蟲蛋白質(zhì)組中監(jiān)測與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的直接生物物理結(jié)合的能力同時(shí)使其適合于鑒定具有先前未確定的作用模式的化合物的藥物靶標(biāo)屈尼。CETSA的無標(biāo)記原則允許其與選擇的寄生蟲菌株和標(biāo)準(zhǔn)未修飾化合物一起使用册着，從而減少合成特殊藥物探針?biāo)璧臅r(shí)間和成本。我們相信脾歧，惡性瘧原蟲MS-CETSA的開發(fā)可以補(bǔ)充現(xiàn)有工具甲捏，促進(jìn)抗瘧藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)工作，并有助于進(jìn)一步加深我們對(duì)寄生蟲生物學(xué)的理解鞭执。
