深圳華大生命科學(xué)研究院聯(lián)合華中農(nóng)業(yè)大學(xué)等團(tuán)隊(duì)，利用華大自主研發(fā)的Stereo-seq時(shí)空組學(xué)技術(shù)须蜗，結(jié)合多切片策略奕翔，在單細(xì)胞分辨率水平上嫌术，對斑馬魚受精后24 h（hpf, hour post-fertilization）以內(nèi)6個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)（3.3、5.25、10、12夹孔、18、24 hpf）的胚胎進(jìn)行研究析孽。研究人員首次繪制了斑馬魚胚胎早期發(fā)育的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜搭伤，構(gòu)建了在組織空間維度上的發(fā)育軌跡。此研究能夠直觀地觀察到袜瞬，在原位組織上細(xì)胞是如何分化怜俐、遷移并發(fā)育形成各組織器官的。該文章于2022年5月4日發(fā)表在Developmental Cell邓尤。

研究人員還構(gòu)建了一個(gè)高質(zhì)量的斑馬魚胚胎發(fā)生時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜（zebrafifish embryogenesis spatiotemporal transcriptomic atlas拍鲤，ZESTA）。

#?ZESTA

ZESTA利用Stereo-seq技術(shù)分析了斑馬魚胚胎發(fā)育過程中基因表達(dá)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的時(shí)空動態(tài)裁赠。用戶可通過數(shù)據(jù)庫主頁面或?qū)Ш綑诘钅焖佾@取研究內(nèi)容梗概、時(shí)空和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聚類分析結(jié)果佩捞、空間分辨發(fā)展軌跡绞幌、研究技術(shù)（Stereo-seq）簡介、研究中使用分析軟件及產(chǎn)生的數(shù)據(jù)資源信息一忱，同時(shí)還能直接下載研究數(shù)據(jù)莲蜘。

期刊：Developmental Cell

數(shù)據(jù)編號：CNP0002220

數(shù)據(jù)庫：https://db.cngb.org/stomics/zesta/

以下是文章共同第一作者劉暢博士對此項(xiàng)研究成果的詳細(xì)解讀，讀者可結(jié)合ZESTA快速獲取文獻(xiàn)概要帘营、研究數(shù)據(jù)票渠、分析工具、數(shù)據(jù)可視化分析結(jié)果等關(guān)鍵信息芬迄。

研究背景

在嚴(yán)格的時(shí)空調(diào)控下问顷，脊椎動物胚胎在較短時(shí)間窗口內(nèi)，通過基因表達(dá)和細(xì)胞狀態(tài)的劇烈改變促成發(fā)育，這是一個(gè)復(fù)雜的動態(tài)過程杜窄。其中肠骆，轉(zhuǎn)錄因子、信號通路塞耕、細(xì)胞外基質(zhì)等多種因素在細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞命運(yùn)決定過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用蚀腿。在時(shí)間和空間緯度上，探究各個(gè)因素之間的分布關(guān)系和復(fù)雜調(diào)控扫外，是解析胚胎發(fā)育的重要途徑莉钙。

過去幾年，利用單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)筛谚，研究人員已經(jīng)系統(tǒng)地揭示了斑馬魚如何從一個(gè)受精卵發(fā)育成完整個(gè)體的單細(xì)胞分子調(diào)控機(jī)制磁玉。然而，空間維度上理解轉(zhuǎn)錄組調(diào)控發(fā)育的機(jī)制刻获，仍是全面認(rèn)識發(fā)育的主要挑戰(zhàn)蜀涨。斑馬魚胚胎尺寸只有毫米數(shù)量級，目前蝎毡，鮮有空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)能夠滿足其空間分辨率上的研究需求厚柳。

材料和方法

空間轉(zhuǎn)錄組/單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組樣本：受精后3.3、5.25沐兵、10别垮、12、18扎谎、24 h的斑馬魚胚胎碳想。

研究策略：選取受精后24h內(nèi)6個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的斑馬魚胚胎，對總共91張矢狀面冰凍切片進(jìn)行了Stereo-seq分析毁靶，搭建了斑馬魚早期胚胎發(fā)生時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜在線開放資源庫ZESTA (https://db.cngb.org/stomics/zesta/)胧奔。然后，利用基于計(jì)算基因表達(dá)空間分布相似性的空間共變基因模塊预吆，探究了空間功能區(qū)域間的相互調(diào)控作用龙填，并對每個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的Stereo-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，構(gòu)建了斑馬魚胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變和細(xì)胞分子變化的時(shí)空發(fā)育軌跡拐叉，探索性地研究了細(xì)胞空間微環(huán)境與分化方向之間的關(guān)聯(lián)岩遗。最后，分析了斑馬魚胚胎發(fā)生過程中不同潛在互作配體-受體對的動態(tài)空間分布凤瘦，發(fā)現(xiàn)了新的配體-受體對互作模式宿礁，提示了潛在的胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制。

研究結(jié)果

1. 應(yīng)用Stereo-seq技術(shù)獲取斑馬魚早期胚胎發(fā)育的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

選取6個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)（3.3蔬芥、5.25梆靖、10控汉、12、18返吻、24 hpf）的斑馬魚早期胚胎暇番，分別制備成15 μm厚度的冰凍切片，并把組織切片貼在時(shí)空芯片上進(jìn)行Stereo-seq測序（圖1A）思喊。由于胚胎直徑約為1 mm，而芯片大小為1 cm×1 cm次酌，所以可以實(shí)現(xiàn)一張芯片上貼多張切片的策略恨课。以24 hpf胚胎為例，在2張芯片上對總共17張胚胎切片進(jìn)行捕獲測序岳服，發(fā)現(xiàn)24 hpf胚胎不同切片捕獲到的UMI數(shù)和基因數(shù)相當(dāng)（圖1B剂公、圖1C），說明多切片策略能較好地消除不同生物樣本之間的批次效應(yīng)吊宋。同時(shí)纲辽，通過比較分辨率從143 μm（bin 200, 200*200 DNB）到10 μm（bin 15, 200*200 DNB，相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞直徑）的空間聚類效果璃搜，證實(shí)了在10 μm分辨率下能夠得到更加精細(xì)且準(zhǔn)確的分群（圖1D）拖吼。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的spots數(shù)量、UMI數(shù)以及基因數(shù)都足以支持后續(xù)數(shù)據(jù)分析（圖1E~圖1G）这吻。因此吊档，高分辨率的Stereo-seq時(shí)空組學(xué)技術(shù)，結(jié)合多切片策略唾糯，使研究人員對如斑馬魚胚胎這樣的小尺寸生物樣本進(jìn)行發(fā)育圖譜繪制成為了可能怠硼。在此，研究人員構(gòu)建了一個(gè)高質(zhì)量的斑馬魚胚胎發(fā)生時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜（ZESTA）移怯。

2. 斑馬魚胚胎發(fā)育時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜的空間聚類和分子特征

在10 μm的分辨率下香璃，研究人員將6個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的所有胚胎切片合并在一起進(jìn)行無監(jiān)督分群，得到了較為清晰的組織結(jié)構(gòu)和空間特異性（圖2A）舟误。得益于Stereo-seq較高的空間分辨率葡秒，研究人員能夠?qū)Σ煌慕M織器官進(jìn)行更為精細(xì)的細(xì)致分群，同時(shí)結(jié)合各個(gè)區(qū)域的marker基因脐帝，對空間位置相近的組織區(qū)域進(jìn)行更加明確地劃分同云。以3.3 hpf的胚胎為例，聚類能夠得到3個(gè)具有明顯空間分布差異的細(xì)胞分群：marginal blastomere堵腹、superfificial blastomere炸站、deep blastomere（圖2B~圖2E）。3個(gè)分群marker基因的空間分布疚顷、分化前后關(guān)系都與前人報(bào)道一致旱易。此外禁偎，研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些分群中未被報(bào)道的marker基因空間分布和原位雜交分布一致，表明了空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性和新marker基因的發(fā)掘潛力阀坏。

斑馬魚胚胎在受精后發(fā)育到24 h時(shí)如暖，大腦的各個(gè)腦區(qū)已經(jīng)有了明顯的分界線，此時(shí)的神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育得較為成熟忌堂。因此盒至，研究人員針對24 hpf胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了細(xì)致分群，得到了神經(jīng)系統(tǒng)精密的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜士修，在超高分辨率條件下枷遂，進(jìn)一步利用數(shù)據(jù)去揭示一些單細(xì)胞數(shù)據(jù)無法回答的問題（圖2F、圖2G）棋嘲。例如酒唉，在后腦結(jié)構(gòu)中，通過細(xì)致分群發(fā)現(xiàn)了一群位于后腦背側(cè)的神經(jīng)干細(xì)胞和位于后腦腹側(cè)的神經(jīng)前體細(xì)胞沸移。對這兩群細(xì)胞進(jìn)行擬時(shí)序分析痪伦，得到的干細(xì)胞分支和神經(jīng)前體細(xì)胞分支分別處于擬時(shí)序的先后位置（圖2H）。根據(jù)這2個(gè)分支雹锣，細(xì)胞能夠被進(jìn)一步分成5個(gè)state网沾，通過比較這些state細(xì)胞類群的差異表達(dá)，也能區(qū)分這些分支細(xì)胞類群的分化特性（圖2I~圖2K）笆制。如state 1的細(xì)胞主要表達(dá)干性marker基因绅这，而state 2這一分支的細(xì)胞高表達(dá)mRNA翻譯相關(guān)基因，提示這一分支干細(xì)胞較state 1更趨向于分化在辆，state 3的這群神經(jīng)元前體細(xì)胞則更趨向表達(dá)神經(jīng)元前體相關(guān)marker基因证薇。同時(shí)，進(jìn)一步結(jié)合每個(gè)state所處的空間位置匆篓，研究人員發(fā)現(xiàn)浑度，state 1這群干細(xì)胞更傾向于分布在斑馬魚前側(cè)和背側(cè)，而state 2這群干細(xì)胞傾向于分布在斑馬魚后側(cè)和腹側(cè)鸦概。這一發(fā)現(xiàn)揭示了后腦神經(jīng)干細(xì)胞的分化異質(zhì)性空間分布箩张，是對前人認(rèn)知的一個(gè)補(bǔ)充。

3. 空間共變基因模塊揭示了斑馬魚胚胎不同功能區(qū)域之間的相互作用

基因在空間分布上存在差異窗市，表達(dá)分布相似的基因所聚集形成的模塊能夠提示胚胎不同的功能區(qū)域先慷。為了識別顯示相似空間分布的共同變化基因，研究人員利用Hotspot計(jì)算基因表達(dá)的空間分布相似性咨察，在每個(gè)胚胎上劃分空間表達(dá)分布相似的共變基因模塊论熙。通過GO分析對每個(gè)模塊進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)這些模塊的功能與所處的空間位置以及所聚集的細(xì)胞類型都是高度一致的摄狱，提示Hotspot計(jì)算的準(zhǔn)確性（圖3A脓诡、圖3C）无午。進(jìn)一步圍繞空間這一要素對斑馬魚胚胎發(fā)育進(jìn)行挖掘，以便能夠?qū)臻g共變基因模塊之間的互作關(guān)系進(jìn)行分析祝谚。如通過對其中分布范圍廣且包含多個(gè)細(xì)胞類型的中腦-后腦邊界神經(jīng)脊椎骨（M12）模塊進(jìn)行GO分析（圖3B宪迟、圖3D），發(fā)現(xiàn)與M12相關(guān)的生物功能與神經(jīng)嵴（neural crest）的不同分化方向有關(guān)交惯。通過可視化不同分化方向間基因的互作關(guān)系次泽，可以發(fā)現(xiàn)神經(jīng)嵴分化的重要調(diào)控因子sox10，以及在不同分化方向中調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)決定的重要互作基因（圖3E~圖3G）席爽。除了模塊內(nèi)的信息挖掘之外箕憾，研究人員還可視化了空間位置臨近的模塊之間的基因互作關(guān)系。例如拳昌，構(gòu)建了脊索/肋板（notochord/floor plate）相關(guān)模塊前神經(jīng)脊椎骨（M13）與臨近空間模塊肌肉系統(tǒng)（M1）、脊髓（M5）之間互作關(guān)系（圖3A钠龙、圖3H）炬藤，挖掘了在notochord/floor plate中表達(dá)的重要分子shha，對周圍組織發(fā)育的調(diào)控作用（圖3I碴里、圖3J）沈矿。

4. 整合scRNA-seq和Stereo-seq數(shù)據(jù)，構(gòu)建具有空間信息的細(xì)胞發(fā)育軌跡

為了更精確地描繪胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞分化軌跡咬腋，研究人員選取了與時(shí)空轉(zhuǎn)錄組6個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對應(yīng)的斑馬魚胚胎羹膳，利用華大自主研發(fā)的DNBelab C4平臺進(jìn)行單細(xì)胞測序。在完成scRNA-seq數(shù)據(jù)聚類后根竿，利用SPOTlight整合scRNA-seq和Stereo-seq數(shù)據(jù)陵像，預(yù)測每一個(gè)單細(xì)胞類群的空間位置（圖4A）。例如寇壳，3.3 hpf胚胎SPOTlight整合預(yù)測的scRNA-seq細(xì)胞分群位置結(jié)果醒颖，與Stereo-seq數(shù)據(jù)中不同分群的空間位置高度一致，提示了SPOTlight整合分析二者數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性壳炎。緊接著泞歉，研究人員先利用scRNA-seq數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞分化軌跡的桑基圖匿辩，再將scRNA-seq的不同分化軌跡腰耙，利用SPOTlight映射到6個(gè)時(shí)間點(diǎn)胚胎切片的不同空間位置上，描述了細(xì)胞分化過程中的空間分布及動態(tài)變化（圖4B~圖4E）铲球。從赏ε樱基圖的分支結(jié)果來看，來自于同一祖細(xì)胞的子細(xì)胞睬辐，在發(fā)育的特定時(shí)間點(diǎn)走向不同的細(xì)胞命運(yùn)（圖4F）挠阁。通過SPOTlight映射宾肺，發(fā)現(xiàn)在子細(xì)胞分化到不同命運(yùn)之前的上一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其祖細(xì)胞就呈現(xiàn)出不同的空間分布侵俗，且此時(shí)調(diào)控不同命運(yùn)走向的轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)祖細(xì)胞具有相似的空間分布锨用，從而調(diào)控不同祖細(xì)胞的命運(yùn)決定（圖4G~圖4I）。綜上隘谣，細(xì)胞所處的空間微觀環(huán)境與其分化方向密切相關(guān)增拥，而這一信息僅憑單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)是無法獲得的。

5. 斑馬魚胚胎發(fā)育進(jìn)程中潛在互作配體-受體對的時(shí)空分布動態(tài)變化

除細(xì)胞內(nèi)因子外寻歧，細(xì)胞外如配體-受體對的互作掌栅，對胚胎發(fā)育也起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。研究人員通過計(jì)算在斑馬魚胚胎6個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)中不同受體-配體對之間的相對距離码泛，推測配體-受體之間的潛在互作關(guān)系（圖5A）猾封。通過與隨機(jī)基因間距離的比較，以及空間分布相關(guān)性的篩選噪珊，設(shè)定至少在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)空間相對距離小于bin 5的配體-受體對具有潛在互作的可能晌缘。通過計(jì)算潛在互作配體-受體對的表達(dá)強(qiáng)度和相對距離，并根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)對它們進(jìn)行排序痢站，探掘不同互作配體-受體對在胚胎發(fā)育中的動態(tài)變化（圖5B）磷箕。由于Notch信號通路在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，研究人員首先通過不同方式展現(xiàn)了Nocth信號通路中的潛在配體-受體對動態(tài)變化阵难。隨后岳枷，計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)中與Notch信號通路具有空間相似分布的基因模塊（圖5C），通過GO分析發(fā)現(xiàn)呜叫，Nocth信號通路在10空繁、12 hpf兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)主要調(diào)控體節(jié)的形成；18 hpf時(shí)朱庆，在體節(jié)生成和神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域都存在互作家厌；24 hpf時(shí)則主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)，表明在斑馬魚胚胎發(fā)育不同時(shí)間點(diǎn)椎工，Notch信號通路對不同組織器官的發(fā)育起到調(diào)控作用饭于，這一結(jié)論也與前人報(bào)道一致。此外维蒙，研究人員還通過潛在配體-受體對動態(tài)變化掰吕，挖掘了一些新的互作模式（圖5D~圖5H），例如Midkine （mdk）家族基因在胚胎發(fā)生中參與神經(jīng)系統(tǒng)的生成颅痊。該研究結(jié)果數(shù)據(jù)系統(tǒng)地揭示了與配體mdka在不同時(shí)間段及不同組織結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生互作的一系列受體殖熟，給后續(xù)的調(diào)控機(jī)制研究提供了參考。

總結(jié)

該研究利用Stereo-seq時(shí)空轉(zhuǎn)錄組技術(shù)斑响，以受精后24 h之內(nèi)6個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的斑馬魚胚胎為研究對象菱属，繪制了斑馬魚胚胎發(fā)育的空間轉(zhuǎn)錄圖譜钳榨。在10 μm的分辨率下，對不同時(shí)間點(diǎn)的斑馬魚胚胎進(jìn)行了空間區(qū)域的劃分纽门，區(qū)分出不同組織邊界薛耻。同時(shí)通過進(jìn)一步的細(xì)化分群，在空間位置上區(qū)分出空間位置臨近的不同細(xì)胞亞群和組織赏陵。由此研究人員得以在超高分辨率下饼齿，得到單細(xì)胞測序得不到的信息，如后腦干細(xì)胞分化異質(zhì)性的空間分布差異等蝙搔。

同時(shí)根據(jù)空間分布相似性缕溉，在不同時(shí)間點(diǎn)的斑馬魚胚胎上劃分出基因表達(dá)共變模塊，通過相同模塊或不同模塊之間基因互作網(wǎng)絡(luò)分析吃型，進(jìn)一步探究了空間功能區(qū)域間的相互調(diào)控作用证鸥。該研究選取時(shí)空組相對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的胚胎，進(jìn)行單細(xì)胞測序勤晚，并利用SPOTlight整合scRNA-seq和Stereo-seq數(shù)據(jù)敌土，繪制了斑馬魚胚胎的空間發(fā)育軌跡。最后运翼，通過計(jì)算空間中不同時(shí)間點(diǎn)中配體-受體對的相對距離，發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中具有潛在互作關(guān)系的配體-受體對兴枯，并確認(rèn)了其在發(fā)育中具有的潛在調(diào)控功能血淌。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步了解脊椎動物胚胎發(fā)育提供理論參考。

參考文獻(xiàn)：

Liu C, Li R, Li Y, et al. Spatiotemporal mapping of gene expression landscapes and developmental trajectories during zebrafish embryogenesis[J]. Developmental Cell, 2022.