hello，大家好嚼蚀，今天我們繼續(xù)分享單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的文章，大家如果看我的文章也應(yīng)該發(fā)現(xiàn)了管挟，空間轉(zhuǎn)錄組越來越多的用來解釋關(guān)鍵細(xì)胞類型的生態(tài)位轿曙，非常重要，關(guān)于生態(tài)位的問題僻孝，我之前分享了一篇导帝，文章在10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組穿铆、VDJ您单、空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析識別人肺組織的免疫細(xì)胞生態(tài)位，解析的是空間層面肺組織免疫細(xì)胞的生態(tài)位悴务，而今天我們要利用單細(xì)胞空間技術(shù)睹限，解析肝臟組織的巨噬細(xì)胞的生態(tài)位，參考的文章在Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily-conserved hepatic macrophage niches 讯檐，非常棒的文章羡疗，我們今天就來分享。
研究需要注意的熱點
- 目標(biāo)細(xì)胞的生態(tài)位
- 生態(tài)位保守的通訊信號
- 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單核轉(zhuǎn)錄組對細(xì)胞類型的捕獲存在差異
- 細(xì)胞區(qū)域通訊（生態(tài)位信號交流别洪，也就是臨近通訊）
Abstract
肝臟是身體中最大的實體器官叨恨，但它的特征仍然不完整。 在這里挖垛，研究展示了健康人和鼠肝臟的空間蛋白質(zhì)基因組圖譜痒钝，結(jié)合了單細(xì)胞 CITE-seq秉颗、單核測序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和空間蛋白質(zhì)組學(xué)送矩。 通過整合這些多組學(xué)數(shù)據(jù)集蚕甥，提供了經(jīng)過驗證的策略來可靠地區(qū)分和定位所有肝細(xì)胞。 然后在七個物種中align這個圖譜栋荸，揭示真正的
Kupffer cells and bile-duct macrophages的保守程序菇怀。 **還揭示了這些巨噬細(xì)胞各自的空間分辨細(xì)胞生態(tài)位和驅(qū)動它們獨特轉(zhuǎn)錄組學(xué)特性的microenvironmental circuits。 分析證明膽管巨噬細(xì)胞是由局部脂質(zhì)暴露誘導(dǎo)的晌块，而Kupffer細(xì)胞主要依賴于它們通過進(jìn)化保守的 ALK1-BMP9/10 軸與肝星狀細(xì)胞的crosstalk 爱沟。
Introduction
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的巨大技術(shù)進(jìn)步使人們能夠更好地了解跨物種不同器官的細(xì)胞組成。然而匆背，仍然缺乏關(guān)于這些細(xì)胞如何在其獨特的微環(huán)境生態(tài)位中組織的信息呼伸。此外，確定組織內(nèi)單個細(xì)胞身份的特定細(xì)胞-細(xì)胞相互作用仍有待研究钝尸。雖然肝臟內(nèi)肝細(xì)胞的空間組織已被了解括享，但非實質(zhì)肝細(xì)胞的空間組織仍不清楚，這是小鼠肝臟的情況蝶怔，但對于人類肝臟更是如此奶浦，其中大多數(shù)肝細(xì)胞的身份和精確定位是未知的。此外踢星，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的聯(lián)系尚未得到研究澳叉，導(dǎo)致缺乏可靠的表面標(biāo)記來通過流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡識別、純化或定位這些細(xì)胞沐悦。在這里成洗，使用了包括 CITE-seq 和空間方法在內(nèi)的蛋白質(zhì)基因組學(xué)技術(shù)來識別小鼠和人類健康肝臟內(nèi)的所有細(xì)胞及其特定位置。通過這樣做藏否，制定了識別和進(jìn)一步研究不同細(xì)胞類型的策略瓶殃。為了證明這種方法的有效性，利用這些信息副签，還確定了在健康肝臟中驅(qū)動不同肝巨噬細(xì)胞表型的保守空間相關(guān)信號遥椿。
Results
A practical proteogenomic atlas of the murine liver
為了生成肝臟的蛋白質(zhì)基因組圖譜，首先檢查了檢索所有肝細(xì)胞的最佳方法淆储。 使用鼠肝臟冠场，使用通過離體或體內(nèi)酶消化分離的細(xì)胞與單核 RNA 測序 (snRNA-seq) 比較了單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq)。 使用每種技術(shù)本砰，我們都觀察到了不同的細(xì)胞組成（看來單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單核轉(zhuǎn)錄組表征細(xì)胞豐度上還是有差異）碴裙。
- 注： UMAPs showing annotations of cell-types and proportions of each cell type as a % of total cells in the UMAP isolated using (A) ex vivo digestion; 13144 cells, (B) in vivo digestion; 19428 cells and (C) nuclei; 8583 nuclei. (D) Average number of genes/cell in the annotated macrophage population following each isolation method.
雖然 snRNA-seq 產(chǎn)生的基因/細(xì)胞數(shù)量少于 scRNA-seq，但它最好地概括了體內(nèi)觀察到的細(xì)胞頻率
- 注： (E-J) Confocal microscopy images to determine true abundance of (E) fibroblasts and cholangiocytes (F) endothelial cells, (G) macrophages, (H) dendritic cells, (I) B cells and (J) T cells in vivo. Scale bar 200μm. (K) The percentage of each population was calculated based on the percentage of a given population divided by the total number of nuclei. A threshold was applied to the DAPI channel (picture 1) in ImageJ (picture 2) and nuclei were automatically counted based on the ImageJ ‘a(chǎn)nalyze particles’ plugin (size (micron^2 = 10-1000; circularity = 0-1; picture 3). Due to the density of some liver zones, some nuclei were not automatically counted (arrow, picture 3)。Those were then manually counted and added to the total number of nuclei. For the populations of interest, cells were counted manually based on specific markers (for example, CD3 for T cells, picture 4). Counting was performed blinded prior to analysis of the sequencing results. (L) Proportion of indicated cell types as a % of total cells identified in confocal microscopy images. Data are from 3-7 images per cell type taken from 2-4 mice.
鑒于每種方法的不同細(xì)胞組成舔株，為確保所有細(xì)胞都可以進(jìn)行分析莺琳，選擇在我們的研究中使用所有protocol的組合。 為了在單細(xì)胞分辨率下研究 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)载慈，通過測序 (CITE-seq) 使用轉(zhuǎn)錄組和表觀的細(xì)胞indexing惭等。 因此，用 107-161 寡偶聯(lián)抗體對選定的 scRNA-seq 樣本進(jìn)行染色办铡。將數(shù)據(jù)匯集在一起進(jìn)行單一分析咕缎，其中使用 TotalVI 將蛋白質(zhì)和 mRNA 譜都考慮用于聚類。
- 注：(A) Hepatic cells were isolated from healthy C57B/l6 mice by ex vivo (5 mice, 15 samples) or in vivo (5 mice, 19 samples) enzymatic digestion. Alternatively, livers were snap frozen and nuclei isolated by tissue homogenization (4 mice, 12 samples). Live cells/intact nuclei were purified using FACS. For cells, total live, live CD45+, live CD45-, live hepatocytes or myeloid cells (live CD45+,CD3-, CD19-, B220-, NK1.1-) were sorted. 18 cell preparations (7 ex vivo, 11 in vivo) were also stained with a panel of 107-161 barcode-labelled antibodies for CITE-seq analysis. All datasets were pooled together and after QC 185894 cells/nuclei were clustered using TotalVI. (B) UMAP of sc/snRNA-seq data
對差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)的分析確定了 17 種細(xì)胞類型料扰。 此外，確定了所有細(xì)胞的表面標(biāo)志物焙蹭，包括Kupffer細(xì)胞 (KCs) 的 VSIG4 和 FOLR2晒杈。
- 注：(A,B) Top DEGs (A) and DEPs (B) for cell types identified in Fig. 1B. (C) Distinct profiles of cells or nuclei within the UMAP depending on isolation protocols; 71162 cells from ex vivo digestions, 96066 cells from in vivo digestions and 18666 nuclei. (D) Expression of VSIG4, CD206 and ESAM (protein, top) and Vsig4, Mrc1 and Esam (mRNA, bottom).
Distinct spatial orientation of hepatic myeloid cell subsets
為了定位鑒定出的細(xì)胞，使用 Visium 進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析孔厉。 為此拯钻，以兩個不同的方向切割肝臟，以描繪肝臟組織和被膜
- 注： Tissue and capsule images from Visium analysis with clusters overlaid.
沿著空間軌跡對每個 Visium 點進(jìn)行排序撰豺，并根據(jù)已知的肝細(xì)胞分區(qū)標(biāo)記對入口粪般、門靜脈周圍、中部和中央?yún)^(qū)域進(jìn)行注釋
- 注：(D) UMAP of zonation of Visium spots (left) & origin of the cells (right). (E) Zonation pattern
mapped onto tissue slice
通過使用參考 sc/snRNA-seq 數(shù)據(jù)污桦，我們將每個點解卷積為其組成細(xì)胞類型亩歹，并研究細(xì)胞豐度如何隨分區(qū)變化
- 注： Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto the Visium zonation data
據(jù)報道，驗證這種方法時凡橱，膽管細(xì)胞專門映射到門脈區(qū)小作，而 KCs 位于門脈周圍和中間區(qū)。 此外稼钩，我們在所有區(qū)域都發(fā)現(xiàn)了 T 細(xì)胞顾稀、內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 和基質(zhì)細(xì)胞 (SC)，而在門靜脈中發(fā)現(xiàn)了常規(guī)樹突狀細(xì)胞 (cDC)坝撑，在中央靜脈中發(fā)現(xiàn)了少量存在静秆。
為了以單細(xì)胞分辨率驗證這些位置，接下來試圖確定也可以通過共聚焦顯微鏡工作的最佳細(xì)胞特異性表面標(biāo)記巡李。 由于用于共聚焦顯微鏡的固定步驟通常會影響不同表位的完整性抚笔，因此無法預(yù)測哪些在單細(xì)胞懸液上起作用的抗體將在固定和完整組織上起作用。 因此击儡，為了同時篩選多種抗體以識別通過顯微鏡起作用的抗體塔沃，進(jìn)行了第二次 Visium 分析，并補充了 100 種寡偶聯(lián)抗體（Visium 高度多重蛋白），這些抗體是根據(jù) CITE-seq 結(jié)果選擇的蛀柴。
- 注： mRNA zonation pattern in Visium Highly-Multiplexed Protein analysis and VSIG4-ADT expression pattern (left) and zonated expression patterns of indicated antibodies (right).
然后螃概，使用 MACSimaTM 成像循環(huán)染色 (MICS) 技術(shù)和 60 重抗體panel，以單細(xì)胞分辨率驗證在空間上起作用的抗體
- 注：MICS analysis of indicated proteins and cell types. (J) Molecular Cartography of indicated genes and cell types
Unfortunately鸽疾，無法為所有populations識別出有用的表面標(biāo)記吊洼，例如，沒有識別出足夠的區(qū)分性表面標(biāo)記制肮，這些標(biāo)記可以通過共聚焦顯微鏡在空間上區(qū)分 cDC 亞群冒窍。 因此，為了確認(rèn)這些細(xì)胞亞群的位置豺鼻，求助于允許 100 重空間 mRNA 分析的 Molecular CartographyTM (Resolve BioSciences)综液。 基于來自 sc/snRNA-seq 數(shù)據(jù)的 DEG 選擇基因，這些數(shù)據(jù)也根據(jù) Visium 進(jìn)行了空間解析儒飒。 還使用膽管細(xì)胞基因（Epcam谬莹、Spp1）和已知的分區(qū)肝細(xì)胞基因（Glul、Cyp2e1桩了、Hal附帽、Sds）確定了該數(shù)據(jù)集中的portal-central軌跡
- 注： (F) Top unbiased genes defining zonation trajectory from portal to central vein in Visium.(H) Molecular Cartography showing expression of indicated zonated hepatocyte mRNAs in liver tissue. Data are representative of 2 mice.
使用 Xcr1、Clec9a (cDC1s) 和 Cd209a井誉、Mgl2 和 Clec10a (cDC2s) 的表達(dá)蕉扮，我們證實 cDC1s 和 cDC2s 主要位于門靜脈
- 注：Molecular Cartography of indicated genes and cell types
由于 cDC2s 與單核細(xì)胞衍生的細(xì)胞共享許多基因，還檢查了一般單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（Cd14颗圣、Adgre1喳钟、Axl、Mafb欠啤、Cx3cr1荚藻、C5ar1）和 KC 特異性基因（Cd5l、Vsig4）的表達(dá)洁段，to further validate their identification as bona fide cDC2s.应狱。 該分析進(jìn)一步表明，鑒定的 cDC2s 是真正的 cDC2s祠丝，缺乏任何巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞標(biāo)志物疾呻，然而，它還鑒定了不同于 KCs 和 cDC2s 的門靜脈和中央靜脈巨噬細(xì)胞群写半。這些分析中 mRNA 表達(dá)的punctate nature與髓樣細(xì)胞的樹突形狀相結(jié)合岸蜗，使得很難令人信服地確定細(xì)胞邊界并得出結(jié)論，這些 cDC2 和巨噬細(xì)胞是不同的細(xì)胞叠蝇。 為了驗證這一點璃岳，開發(fā)了一種將 mRNA 檢測 (RNAScope) 與表面蛋白檢測相結(jié)合的protocol。 結(jié)合蛋白質(zhì)表面標(biāo)記檢查 cDC 或巨噬細(xì)胞特異性 mRNA 的表達(dá)證實了門靜脈 cDC1、cDC2 和非 KC 巨噬細(xì)胞的存在
- 注： mRNA (Xcr1, Flt3l, Mafb and Clec10a) and protein (MHCII and F4/80) expression in the same tissue slice. Scale bar 50μm. PV; portal vein, CV; central vein. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.
總之铃慷，通過結(jié)合多種空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法单芜，定位了小鼠肝臟內(nèi)的所有細(xì)胞，并確定了骨髓細(xì)胞內(nèi)的額外異質(zhì)性犁柜，在單獨檢查 sc/sn-RNA-seq 數(shù)據(jù)集時沒有發(fā)現(xiàn)洲鸠。 這突出了結(jié)合單細(xì)胞和空間蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來研究細(xì)胞異質(zhì)性的力量。
Refined analysis of myeloid cells identifies three subsets of hepatic macrophages
為了更好地理解這些非 KC 巨噬細(xì)胞馋缅，我們在定義 11 個群體的 sc/snRNA-seq 分析中zoomed in骨髓細(xì)胞（cDC扒腕、KC、單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生細(xì)胞）
這包括 KC萤悴、3 組非 KC 巨噬細(xì)胞和細(xì)胞瘾腰，其特征介于單核細(xì)胞和 patrolling monocytes 或巨噬細(xì)胞之間，稱為過渡單核細(xì)胞覆履。 對非 KC 巨噬細(xì)胞的仔細(xì)檢查發(fā)現(xiàn) cluster6 是腹膜巨噬細(xì)胞居灯。 其余clusters之間的 DEG 表明 cluster7 可能類似于膠囊巨噬細(xì)胞，表達(dá) Cd207 和 Cx3cr1内狗，而 cluster8 類似于我們最近在脂肪肝中描述的 Gpnmb+Spp1+ 脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞 (LAMs)。Conversion of the CITE-seq data into a flow cytometry file allowed an gating strategy to be defined.驗證這一點义锥，利用該策略來純化cluster并評估基因表達(dá)柳沙。 在消化前清洗肝臟可以使清洗部分中的腹膜巨噬細(xì)胞富集，這表明這些是肝臟表面的污染物拌倍，而不是存在于肝臟組織本身中赂鲤。 雖然 CITE-seq 標(biāo)記不能區(qū)分cluster 7 和 8，但在panel中添加 CD207 使非 KC 能夠分為 CD207+ 和 CD207- 巨噬細(xì)胞柱恤。 與它們被稱為膠囊巨噬細(xì)胞的名稱相吻合数初，如果解剖和消化膠囊，CD207+ 巨噬細(xì)胞的相對豐度就會增加梗顺。 然而泡孩，盡管分子圖譜證實了膠囊中存在 Cd207+ 巨噬細(xì)胞，但它也揭示了中央靜脈的 Cd207+ 巨噬細(xì)胞寺谤，而門靜脈很少發(fā)現(xiàn)這種巨噬細(xì)胞.
- 注： (E) Expression of VSIG4 and F4/80 (left) or MHCII, CD11c and DAPI (right) by confocal microscopy. Capsule macrophages (left) or MHCII+ capsule macrophages (right) identified by white arrows. Scale bar 50μm. (F) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at liver capsule. (G) Expression of VSIG4, F4/80, GLUL and DAPI (left) or F4/80 or CCR2 (right, inset) by confocal microscopy. Scale bar 100μm. (H) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at portal triad. PV; portal vein, CV; central vein, HA; hepatic artery and BD; bile duct. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.
因此仑鸥，cluster7 由囊和中央靜脈 CD207+ 巨噬細(xì)胞組成。 這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明需要空間方法來確認(rèn)細(xì)胞身份变屁，因為這種特征以前被認(rèn)為是膠囊巨噬細(xì)胞群所獨有的眼俊。 分子圖譜還在門靜脈和中央靜脈處鑒定出巨噬細(xì)胞，表達(dá) Ccr2 和 Chil3粟关，類似于過渡單核細(xì)胞（cluster11）疮胖。 最后，發(fā)現(xiàn)一群表達(dá) Gpnmb 的巨噬細(xì)胞專門位于膽管周圍。 由于 Gpnmb 表達(dá)是 cluster8 特異性的澎灸，并且這些細(xì)胞類似于 LAM院塞，我們將這些細(xì)胞稱為膽管 LAM。
Macrophage subsets reside in distinct spatial niches
由于所有巨噬細(xì)胞群都與其局部環(huán)境中的 CD45- 細(xì)胞密切接觸击孩，進(jìn)一步分析了 CD45- 細(xì)胞迫悠，確定了 EC 和 SC 的多個亞群以及區(qū)分它們的gating strategy。EC 可以進(jìn)一步細(xì)分為 4 個不同的cluster巩梢，對其位置的分析使它們能夠被識別為中央靜脈 EC（cluster 10）创泄、LSEC（cluster 9）、門靜脈 EC（cluster 11）和淋巴 EC（LEC括蝠；cluster 12）鞠抑。由于 Visium 在門靜脈和中央靜脈中都發(fā)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞，并且正如之前的一份報告表明這些細(xì)胞中存在不同的亞群忌警，我們進(jìn)一步分析 SCs 以更好地評估它們的異質(zhì)性搁拙。 這揭示了僅限于膠囊的間皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的亞群。 Myh11+ 血管平滑肌細(xì)胞 (VSMCs) 位于肝動脈法绵、門靜脈和中央靜脈周圍箕速，發(fā)現(xiàn) Mfap4+Svep1+Clic5-Reln-成纖維細(xì)胞是中央靜脈成纖維細(xì)胞。 最后朋譬，確定了位于膽管細(xì)胞周圍的 Clic5+Reln+ 成纖維細(xì)胞 (cluster3) 的一個subset盐茎，將其稱為膽管成纖維細(xì)胞。 總之徙赢，這些空間上不同的 ECs 和 SCs 子集的存在突出了不同巨噬細(xì)胞種群所在的特定微環(huán)境的獨特性字柠。
- 注：Hepatic macrophage populations reside in distinct niches。(A) UMAP of murine CD45- cells (83410 cells/nuclei) isolated from Fig. 1B and re-clustered with TotalVI. (B,C) Top DEGs (B) and DEPs (C) between cell types identified. (D) Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto the Visium zonation data. (E) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at central vein (left) and 2 different portal triads (center and right). (F) UMAP of murine stromal cells (5430 cells/nuclei) isolated from the UMAP in Fig. 3A and reclustered with scVI. (G) Top DEGs between different cell types identified. (H) Identification of Mesothelial cell (top) and VSMC (bottom) signatures on zonated Visium data. (I) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at the liver capsule. (J) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at the central vein (left) and portal triad (right). PV; portal vein, CV; central vein, HA; hepatic artery and BD; bile duct. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.
A practical proteogenomic atlas of the healthy human liver
為了確定巨噬細(xì)胞亞群之間的保守程度及其在小鼠和人類肝臟之間的不同微環(huán)境生態(tài)位狡赐，我們接下來使用 sc/snRNA-seq 和 CITE-seq 對 19 次肝臟活檢生成了人類肝臟的蛋白質(zhì)基因組圖譜窑业。其中，大多數(shù)在組織學(xué)上是健康的枕屉，只有 5 名患者表現(xiàn)出>10% 的肝脂肪變性常柄。細(xì)胞比例因所使用的隔離技術(shù)而異，雖然患者之間存在一些差異搀擂，但這與手術(shù)無關(guān)拐纱。由于 Visium 可靠地定位了鼠肝細(xì)胞，我們使用它來定位 4 次活組織檢查中的人類肝臟細(xì)胞哥倔。由于>10% 脂肪變性的患者與健康樣本（<10% 脂肪變性）分開聚集秸架，使用健康樣本來計算基線分區(qū)，然后將此軌跡轉(zhuǎn)移到脂肪變性樣本上。這確定了這些患者的脂肪變性主要位于中心周圍。這與之前的臨床研究相吻合，即中央周圍脂肪變性在 NAFLD 患者中最常見斥扛，尤其是在門靜脈周圍區(qū)域通常不受累的早期疾病中缭黔。值得注意的是食茎，盡管中性粒細(xì)胞優(yōu)先位于脂肪變性區(qū)，但整體細(xì)胞分布不受中央周圍脂肪變性的影響
- 注：Identification of bona fide Kupffer cells across species 馏谨。(A) Cells or nuclei were isolated from liver biopsies (~1-2mm3; 14 cells, 5 nuclei) from patients undergoing either liver resection, cholecystectomy or gastric bypass. Live cells/intact nuclei were purified using FACS. Either total live, live CD45+, live CD45- or lineagecells (live CD45+,CD3-,CD19-) were sorted. 7 cell samples were stained with a panel of 198 barcode-labelled antibodies for CITE-seq analysis. All datasets were pooled together and after QC 167598 cells/nuclei were analyzed using TotalVI. (B) UMAP of sc/snRNA-seq data. (C) UMAP of Visium data from 4 patient biopsy samples. (D) Split of Visium spots based on %steatosis. (E) Healthy and steatotic Visium liver tissue with clusters overlaid and H+E staining to identify steatotic zones. (F) Zonation of Visium data (top) with zonation pattern mapped onto liver tissue (bottom). (G) Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto Visium zonation trajectory, healthy (top), steatotic (bottom).别渔、
An evolutionarily-conserved program of KCs
迄今為止，還沒有描述真正的人類 KCs 的經(jīng)過驗證的標(biāo)記惧互。在解釋準(zhǔn)確定義人類 KCs 的困難時哎媚，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在人類 sc/snRNA-seq 數(shù)據(jù)中形成了一個單一的連續(xù)體，阻止了人類 KCs 的簡單定義喊儡。為了進(jìn)一步研究潛在的人類肝臟巨噬細(xì)胞異質(zhì)性拨与，我們分析了骨髓細(xì)胞，確定了 10 個cluster艾猜。為了定義 KC买喧，接下來檢查了這些cluster對前 25 個鼠類 KC 基因的表達(dá)，這些cluster確定了 cluster10 是真正的人類 KC匆赃。與小鼠不同淤毛，它們優(yōu)先位于中間區(qū)域。 Cluster9 也表達(dá)了許多這些基因算柳，但缺乏 TIMD4钱床，這表明這些細(xì)胞可能是最近招募的單核細(xì)胞衍生的 KCs (moKCs)。盡管單獨的 VSIG4 表達(dá)不能準(zhǔn)確識別人類肝臟中的 KC埠居，但發(fā)現(xiàn) VSIG4 蛋白是 CITE-seq 數(shù)據(jù)中人類 KC 的最佳標(biāo)記物，突出了檢查表面蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的重要性事期。這通過流式細(xì)胞術(shù)和對人肝臟的 VSIG4 和 KC 特異性基因 CD5L 的共染色進(jìn)行了驗證滥壕，這也證實了它們的中帶定位。為了評估 KC 身份在進(jìn)化中是否進(jìn)一步保守兽泣，對獼猴绎橘、豬、倉鼠唠倦、雞和斑馬魚的肝臟進(jìn)行了分析称鳞。我們通過將保守的人-鼠 KC 簽名映射到數(shù)據(jù)集上，以無偏見的方式識別了 KC稠鼻。然后檢查了確定的每個 KC 群體的主要特征冈止。觀察到跨物種轉(zhuǎn)錄組的強烈重疊可能是由于核心 KC 轉(zhuǎn)錄因子的保守表達(dá)。 VSIG4 蛋白表達(dá)在豬和獼猴 KCs 中也是保守的候齿。同樣熙暴，還能夠根據(jù)保守基因識別跨物種的大多數(shù)其他肝細(xì)胞闺属。 cDC2s 是主要的例外，因為特定的 cDC2 標(biāo)記基因并非在所有物種中都是保守的周霉。
LAM location is altered in the steatotic human liver
除了 KCs掂器，還在肝囊中發(fā)現(xiàn)了人類 CD68+VSIG4-巨噬細(xì)胞，靠近中央靜脈和門靜脈以及膽管俱箱。在健康獼猴肝臟的門靜脈和中央靜脈以及膽管中也觀察到了類似的populations 国瓮。檢查 scRNA-seq 數(shù)據(jù)并與小鼠特征進(jìn)行比較，確定了未成熟和成熟的 LAM狞谱，從而能夠定義保守的 LAM 特征乃摹。盡管最近的一項研究表明這些細(xì)胞對纖維化肝臟具有特異性，但在所有使用 scRNA-seq 分析的患者中都發(fā)現(xiàn)了 LAM芋簿，但在 2 個脂肪變性 >10% 的肝臟中峡懈，LAM 的比例有增加的趨勢。與顯微鏡和鼠膽管 LAM 一致与斤，人類 LAM 位于非脂肪肝的匯管區(qū)肪康。然而，在脂肪變性的人類肝臟中撩穿，LAM 主要位于中央周圍磷支，與脂肪變性相關(guān)。在喂食western diet (WD) 36 周以誘發(fā)脂肪肝疾病后食寡，在小鼠中使用 Visium 也驗證了 LAM 位置的這種變化雾狈。在這里，與整個肝臟存在脂肪變性相吻合抵皱，在門靜脈善榛、門靜脈周圍和中間區(qū)域發(fā)現(xiàn)了 LAM。鑒于兩個物種中 LAMs 的位置與過量脂質(zhì)的存在以及發(fā)現(xiàn) LAMs 的不同位置之間的生態(tài)位細(xì)胞的異質(zhì)性相關(guān)呻畸，這表明 LAM 表型和豐度可能受脂質(zhì)暴露而不是特定的在兩個位置保守的局部細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用移盆。
Differential NicheNet analysis across species reveals a crucial role for the ALK1-BMP9/10 axis in KCs.
為了評估保守的細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用與局部代謝物（如脂質(zhì)）在推動跨物種巨噬細(xì)胞異質(zhì)性方面的作用，我們在不同的肝巨噬細(xì)胞和存在于各自nichs中的 CD45-細(xì)胞之間進(jìn)行了差異 NicheNet 分析伤为，重點是配體和在人和小鼠中都保守的受體咒循。與 KCs 相比，這揭示了 LAMs 的特定配體 - 受體對很少绞愚，進(jìn)一步暗示驅(qū)動 LAM 表型的主要信號可能不是來自獨特的細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用叙甸。與此一致，用乙跷获茫化低密度脂蛋白培養(yǎng)的 BM 單核細(xì)胞表達(dá) LAM 相關(guān)基因裆蒸，表明脂質(zhì)在誘導(dǎo) LAM 表型中起主導(dǎo)作用。對形成 KC 生態(tài)位藍(lán)圖的細(xì)胞串?dāng)_的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)糖驴，人和小鼠之間存在多個保守的配體-受體對光戈。其中一個哪痰，KCs（ALK1；由 Acvrl1 編碼）和星狀細(xì)胞（分別由 Gdf2/Bmp10 編碼的 BMP9/10）之間的 ALK1-BMP9/10 回路被發(fā)現(xiàn)在所有 7 個物種中都是保守的久妆，并被預(yù)測控制表達(dá)許多保守的 KC 轉(zhuǎn)錄因子晌杰。為了驗證這個軸，我們生成了 Fcgr1-Cre x Acvrl1fl/fl 小鼠筷弦，從巨噬細(xì)胞中消除了 ALK1肋演。這導(dǎo)致 VSIG4+ KCs 幾乎完全喪失，表明進(jìn)化上保守的 ALK1-BMP9/10 軸對于肝臟中 KC 的存在至關(guān)重要烂琴。
Discussion
為了生成任何人體組織的實用細(xì)胞圖譜并解開對居住在該組織中的細(xì)胞的身份至關(guān)重要的細(xì)胞-細(xì)胞回路爹殊，需要四個關(guān)鍵信息：（i）存在的所有細(xì)胞的清單，（ii）位置 組織內(nèi)不同細(xì)胞之間的相互作用奸绷，以識別相鄰細(xì)胞之間的相互作用梗夸，(iii) 人類和動物模型之間的alignment，允許任何預(yù)測的細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用受到干擾号醉，以及 (iv) 識別可靠的基于抗體的panel有效篩選不同患者和/或轉(zhuǎn)基因動物反症。 在這里，通過整合單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)畔派，為肝臟提供了這 4 條信息铅碍，并揭示了控制肝臟巨噬細(xì)胞發(fā)育的進(jìn)化上保守的microenvironmental circuits。
強調(diào)需要結(jié)合不同的分離策略來正確分析所有肝細(xì)胞线椰，證明如果沒有 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的組合胞谈，肝臟圖譜中將缺乏不同的人和鼠基質(zhì)細(xì)胞亞群。解開所有肝細(xì)胞的空間定位憨愉，確定了健康小鼠烦绳、人類和獼猴肝臟膽管周圍的 LAM。然而配紫，當(dāng)存在脂肪變性時径密，LAMs 會擴張并定位到脂肪變性的周圍區(qū)域，這讓人想起 LAMs 在肥胖小鼠肝臟中的擴張笨蚁。這種空間信息至少部分否定了 LAM 身份是由纖維化基質(zhì)細(xì)胞特異性誘導(dǎo)的假設(shè)，并支持 LAM 主要由局部脂質(zhì)暴露誘導(dǎo)的概念趟庄，正如在實驗中所證明的那樣括细。盡管脂質(zhì)的確切來源仍有待確定。還提供了七個物種的肝臟圖譜的對齊方式戚啥。這揭示了穩(wěn)態(tài) KCs 的保守轉(zhuǎn)錄組程序奋单，并揭示了 KCs 與構(gòu)成其生態(tài)位的細(xì)胞之間的空間限制和保守的配體-受體對。強調(diào)在試圖了解疾病如何擾亂細(xì)胞之前首先表征健康組織的必要性猫十，我們將 DLL-NOTCH 相互作用確定為穩(wěn)態(tài) LSEC 和 KC 之間進(jìn)化保守的串?dāng)_览濒，因此并非肝細(xì)胞癌或纖維化所獨有呆盖，正如最近提出的那樣。同樣贷笛，發(fā)現(xiàn) FOLR2 表達(dá)不是腫瘤相關(guān)肝巨噬細(xì)胞所特有的应又，而是在健康小鼠和人類肝臟的 KCs 上表達(dá)（mRNA 和蛋白質(zhì)）。最后乏苦，應(yīng)用蛋白質(zhì)基因組學(xué)管道株扛，從廣泛的寡偶聯(lián)抗體面板開始，用于單細(xì)胞和空間分析汇荐。這是至關(guān)重要的洞就，因為轉(zhuǎn)錄組分析并不總是與通過流式細(xì)胞術(shù)或顯微鏡檢測蛋白質(zhì)的能力相對應(yīng)。通過廣泛篩選掀淘，確定了分離和定位肝巨噬細(xì)胞及其各自生態(tài)位細(xì)胞的最佳表面標(biāo)志物旬蟋。這既可以驗證單細(xì)胞水平的空間位置，也可以有效篩選轉(zhuǎn)基因小鼠模型的 KCs 損失革娄。使用定義的panel對 Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl 小鼠的表征很容易證明 ALK1-BMP9/10 軸在 KCs 中的重要性倾贰，強調(diào)巨噬細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的串?dāng)_比生長因子的交換更進(jìn)一步。展望未來稠腊，將這些相對便宜的抗體組應(yīng)用于大型患者隊列或多個轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)該能夠有效識別任何擾亂肝臟穩(wěn)態(tài)的擾動躁染。
Methods(關(guān)注一些關(guān)鍵的方法)
Probabilistic graphical modelling （Modelling of Visium data ）
Reference for deconvolution
Deconvolution
Differential abundance along zonation
生活很好，有你更好
