Nature Genetics 高質(zhì)量黑麥基因組揭示重要的農(nóng)藝基因

一睁宰、研究背景

黑麥（Secale cereale, 2n = 2x = 14, RR）屬于禾本科小麥族黑麥屬，雖然與普通小麥（Triticum aestivum糠悯，Ta纺且；2n=6x=42盏道；AABBDD）和大麥（Hordeum vulgare，Hv）有親緣關(guān)系载碌，但黑麥具有獨特的農(nóng)藝性狀和基因組特性猜嘱。黑麥1RS染色體臂攜帶的抗病基因通過遠緣雜交轉(zhuǎn)入小麥基因組，為小麥生產(chǎn)中白粉病和條銹病的防治做出了巨大貢獻嫁艇。此外朗伶，黑麥也可以與普通小麥遠緣雜交，染色體加倍后步咪，人工合成八倍體小黑麥论皆，具有比黑麥更高的生物量和產(chǎn)量。因此猾漫，黑麥是許多國家重要的糧食和飼料作物点晴，也是全球小麥和小黑麥改良的重要遺傳資源。

威寧黑麥是我國的栽培黑麥早抽穗優(yōu)良品種悯周，具有抗白粉病和條銹病的能力觉鼻。為了解析黑麥優(yōu)良性狀的遺傳和分子基礎(chǔ)，促進黑麥及相關(guān)作物的基因組和育種研究队橙，作者對威寧黑麥進行了基因組測序和分析。

二萨惑、材料與方法

基因組：

• 材料：威寧黑麥自交系捐康，自交18代；熒光原位雜交（FISH）確認基因組染色體對=7組庸蔼；
• 測序：270 bp小片段文庫（430Gb, ~54X）解总，Illumina 平臺；20 Kb大片段文庫（497Gb,~63X）姐仅，Pacbio平臺花枫；Hi-C 文庫（560 Gb, ~71X），Illumina平臺掏膏；光學圖譜（779.55 Gb劳翰，~99X），Bionano Irys平臺馒疹；

基因注釋轉(zhuǎn)錄組測序：正臣阳ぃ或脅迫（冷或干旱）條件下栽培的植物中的葉、莖颖变、根和穗樣品生均，以及在開花10听想、20、30马胧、40天后收獲的發(fā)育中的樣品, 采用Illumina及Pacbio平臺進行RNA-seq及Iso-Seq汉买；

遺傳圖譜QTL : 295份威寧黑麥×荊州黑麥雜交的F2代樣品，采用SLAF-seq進行標記開發(fā)佩脊；

抽穗基因表達 : 威寧黑麥和荊州黑麥樣品蛙粘，播種后4、7和10天采集葉片樣品邻吞，每個時間點使用3個生物重復(fù)组题，使用Illumina平臺進行測序；

選擇進化分析 ：已發(fā)表的101份家養(yǎng)黑麥和野生黑麥品種材料的公共數(shù)據(jù)抱冷，包括81份S. cereala崔列、5份S. vavilovii、11份S. strictum和4份S. sylvestre旺遮。

三赵讯、研究內(nèi)容

1. 基因組裝與注釋；
2. 轉(zhuǎn)座子分析耿眉；
3. 黑麥基因組進化和染色體共線性研究边翼；
4. 基因重復(fù)及其對淀粉生物合成基因的影響分析；
5. 黑麥種子貯藏蛋白(SSP)基因位點的解析鸣剪；
6. 轉(zhuǎn)錄因子(TF)及抗病基因的注釋和分析组底；
7. 早抽穗性狀相關(guān)基因表達特征的研究；
8. 黑麥馴化過程中染色體區(qū)域和基因座的挖掘筐骇；

四债鸡、主要研究結(jié)果

1. 基因組裝與注釋

流式預(yù)估黑麥基因組大小約為7.86 Gb，結(jié)合PacBio铛纬、Illumina厌均、Hi-C、遺傳圖譜告唆、BioNano光學圖譜等技術(shù)進行基因組組裝棺弊。最終組裝 7.74 Gb 基因組（為預(yù)估基因組大小的98.47%），scaffold N50 為1.04 Gb擒悬，并將93.67%的序列掛載至7條染色體上（圖1）模她。黑麥中每條染色體基因組大小均在1G左右（2R、3R懂牧、4R缝驳、6R、7R（~1Gb）；1R（0.94097 Gb）用狱、5R（0.99891 Gb) ）运怖，比烏拉爾圖小麥（T. urartu；Tu夏伊；AA型）摇展、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii；Aet溺忧；DD型）咏连、野生二粒小麥（T. turgidum ssp. dicoccoides；WEW鲁森；AABB型）祟滴、普通小麥（Ta）和大麥（Hv）等復(fù)雜的麥類中的 單條染色體基因組均要大 。超大的基因組及染色體歌溉，對黑麥基因組組裝垄懂，特別是染色體掛載帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

圖1 黑麥基因組特征

將組裝結(jié)果與兩個冬季黑麥品種（Lo7和Lo225）構(gòu)建的染色體連鎖圖相比痛垛，威寧黑麥1R至7R物理圖具有較高的一致性草慧。在先前報道的Lo7的pyro-sequencing reads中97.45%可以定位到威寧基因組，平均序列同源性為97.71%匙头，平均序列覆蓋率為97.27%漫谷。

LAI值為 18.42，遠高于先前發(fā)表的小麥和大麥基因組的LAI值蹂析。BUSCO評估結(jié)果為 96.74%舔示。并注釋了86,991個蛋白編碼基因。盡管黑麥基因組非常復(fù)雜电抚，通過以上評估結(jié)果說明斩郎，本次研究構(gòu)建了一個高質(zhì)量的威寧黑麥基因組。

2.轉(zhuǎn)座子分析

威寧黑麥基因組中 90.31% 被注釋為轉(zhuǎn)座子（TE）喻频，共包含537個家族的2,671,941個成員，這些TE的含量明顯比普通小麥 (84.70%), 烏拉爾圖小麥 (81.42%), 節(jié)節(jié)麥 (84.40%), 野生二粒小麥 (82.20%)以及大麥 (80.80%)更高肘迎。其中長末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR-RTs）是主要的轉(zhuǎn)座子甥温，在注釋的TEs中占 84.49% 。

與烏拉爾圖小麥妓布、節(jié)節(jié)麥及大麥的LTR-RTs進行比較發(fā)現(xiàn)：
（1）Gypsy 是威寧黑麥基因組擴張的主要原因之一(Fig. 2a)姻蚓，并且有3個LTR-RT家族（Daniela, Sumaya, Sumana）在威寧黑麥中特異擴張，其中Daniela的占比最高 (Fig. 2b)匣沼。
（2）威寧黑麥中完整的LTR-RTs插入時間存在獨特的 雙峰 分布(Fig. 2c)狰挡，最近一個擴增峰出現(xiàn)在50萬年前，另一個出現(xiàn)在1.7 百萬年（MYA）左右（與大麥相同） (Fig. 2c)。
（3）這種雙峰分布模式由 Gypsy RTs 的擴增主導(dǎo)(Fig. 2d)加叁。

圖2 黑麥中轉(zhuǎn)座子分析

3.黑麥基因組進化和染色體共線性研究

通過比較威寧黑麥倦沧、烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥它匕、普通小麥（亞基因組TaA展融、TaB和TaD）、大麥豫柬、水稻Os（Oryza sativa ssp. japonica）告希、二穗短柄草Bd（Brachypodium distachyon）、玉米Zm（Zea mays）烧给、高粱Sb（Sorghum bicolor）燕偶、谷子Si（Setaria italica）基因組，共找到2517個單拷貝同源基因础嫡。通過對單拷貝基因組構(gòu)建進化樹和計算分化時間發(fā)現(xiàn)指么，在大麥和小麥分化后（15MYA）黑麥和二倍體小麥發(fā)生了分化（9.6 MYA） (Fig. 3a)。

作者以水稻為祖先參考基因組驰吓，研究了威寧黑麥的染色體進化涧尿。威寧黑麥與水稻共鑒定出23個大的共線性區(qū)，包含10949對同源基因檬贰，可推斷出祖先染色體片段在1R到7R之間的排列（圖3b）：
（1）3R來源于一條古老的染色體AGK1/Os1姑廉，該染色體的一段易位到6RL；
（2）1R和2R分別由兩條祖先染色體組成翁涤，1R與AGK10/Os10嵌套插入AGK5/Os5有關(guān)桥言，2R與AGK7/Os7嵌套插入AGK4/Os4有關(guān)；
（3）4R, 5R, 6R,7R是通過復(fù)雜易位從至少三條祖先染色體上獲得的（圖3b）葵礼。

在威寧黑麥基因組與普通小麥3個亞基因組的比較中号阿，1R、2R和3R分別與小麥1鸳粉、2和3組染色體完全共線扔涧。在4R中發(fā)現(xiàn)與4A/4B/4D、7A/7B/7D或6A/6B/6D部分共線性的三個區(qū)域届谈。5R與5A完全共線枯夜，與5B、5D部分共線是由于易位的4B或4D片段在5BL或5DL的長臂融合（圖3c）艰山。在6R中湖雹，觀察到3個區(qū)域與6A/6B/6D、3A/3B/3D或7A/7B/7D部分共線曙搬。這些數(shù)據(jù)將有助于黑麥在禾本科比較基因組學研究以及黑麥與普通小麥雜交研究中的應(yīng)用摔吏。

圖3 黑麥基因組進化及染色體共線性分析

4.基因重復(fù)及其對淀粉生物合成基因的影響分析

作者在威寧黑麥中檢測到4217個單拷貝基因鸽嫂、23753個 分散重復(fù)基因 (DDGs) 、6659個 近端重復(fù)基因 (PDGs) 征讲、7077個 串聯(lián)重復(fù)基因(TDGs) 和1866個 片段重復(fù)基因据某。轉(zhuǎn)座重復(fù)基因（TrDGs）由TE活性誘導(dǎo)的，它們是DDGs的主要組成部分稳诚。作者以大麥為參考哗脖，在威寧黑麥中鑒定出10357個TrDG，遠遠大于以相同方式計算的烏拉爾圖小麥（7145）和節(jié)節(jié)麥（7351）中TrDG的數(shù)量（圖4b）扳还。威寧黑麥所特有的TrDG（5926）也比烏拉爾圖小麥（3513）和節(jié)節(jié)麥（3327）所特有的TrDG更多（圖4b）才避。

接下來作者研究了黑麥淀粉生物合成相關(guān)基因（SBRGs）中的基因復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)類型在黑麥淀粉生物合成相關(guān)基因（SBRGs）中普遍存在氨距，并且不同的 SBRG 的復(fù)制基因之間往往表現(xiàn)出表達差異桑逝，說明不同類型的基因復(fù)制可以豐富黑麥基因在重要生物過程中的遺傳多樣性（圖4c），這些黑麥SBRGs的新變化可能為調(diào)控植物淀粉生物合成和性質(zhì)提供新的酶活性俏让，因此解析全套黑麥SBRGs有利于提高黑麥的產(chǎn)量潛力和營養(yǎng)品質(zhì)楞遏。

圖4 黑麥基因重復(fù)及其對淀粉合成相關(guān)基因多樣性的影響

5.黑麥種子貯藏蛋白(SSP)基因位點的分離

與小麥和大麥相似，黑麥在胚乳組織中積累了豐富的儲存蛋白SSPs首昔。作者利用威寧基因組組裝技術(shù)對黑麥SSP基因座進行了分析寡喝。

在威寧黑麥中未發(fā)現(xiàn)小麥低分子量麥谷蛋白亞基（LMW-GSs）或大麥B-hordein的同源序列（圖5b），表明在黑麥進化過程中攜帶這些基因的染色體片段缺失勒奇，這可能是1BL1RS易位系小麥品種中预鬓，品質(zhì)受影響的主要原因。

并且在威寧黑麥基因組中未發(fā)現(xiàn)α-醇溶蛋白基因赊颠，這說明小麥及其近緣種的α-醇溶蛋白（α-gliadin）基因可能在小麥和黑麥分化之后進化產(chǎn)生的格二。

這些SSP分析結(jié)果闡明了黑麥堿基因座的結(jié)構(gòu)和組成，這將有助于進一步研究黑麥竣蹦、小黑麥和小麥的加工和營養(yǎng)品質(zhì)顶猜。

圖5 黑麥堿位點分析

6.轉(zhuǎn)錄因子(TF)及抗病基因的注釋和分析

作者利用iTAK預(yù)測了威寧黑麥和其他8種禾本科植物的TF基因，在注釋的65個轉(zhuǎn)錄因子基因家族中痘括，威寧黑麥有28個家族成員增加长窄，其中AP2/ERF TF基因家族成員增加幅度較大。威寧黑麥的抗病相關(guān)基因（DRA）數(shù)量（1989）比烏拉爾圖小麥（1621）纲菌、節(jié)節(jié)麥（1758）挠日、大麥（1508）、二穗短柄草（1178）驰后、水稻（1575）以及普通小麥的A（1836）、B（1728）和D（1888）亞基因組多矗愧。

鑒于AP2/ERF TFs和DRA基因在植物對非生物逆境和生物逆境的反應(yīng)中的重要作用灶芝，上述發(fā)現(xiàn)可能有助于黑麥和相關(guān)作物的有效遺傳研究和分子改良郑原。

7. 早抽穗性狀相關(guān)基因表達特征的研究

在長日照條件下，威寧黑麥比荊州黑麥提前抽穗10-12天（圖6a）夜涕，這與威寧黑麥莖尖分生組織發(fā)育更快有關(guān)（圖6b）犯犁。在威寧黑麥基因組中，注釋到在長日照條件下高表達的兩個開花位點（FT）基因ScFT1（ScWN4R01G446100）和ScFT2（ScWN3R01G192500）女器。播種后7天和10天酸役，ScFT1和ScFT2在威寧黑麥中的表達水平顯著高于荊州黑麥（圖6c），且ScFT蛋白在黑麥中積累到相對較高水平驾胆，而荊州黑麥中幾乎沒有（圖6d）涣澡。檢測到的ScFT蛋白的大小（~29 kDa）比預(yù)測出的ScFT1和ScFT2的分子量大（~19 kDa）（圖6d）丧诺，表明ScFT蛋白具有潛在的翻譯后修飾入桂。用高效檢測磷蛋白的磷酸標記SDS-PAGE分析表明，威寧黑麥中ScFT確實發(fā)生了翻譯后磷酸化修飾驳阎。

作者突變了ScFT2磷酸化相關(guān)的兩個殘基（S76和T132）抗愁，并為ScFT2構(gòu)建了一系列去磷模擬位點（S76A、T132A和S76A/T132A）和磷模擬位點（S76D呵晚、T132D和S76D/T132D）蜘腌。當使用馬鈴薯X病毒載體在煙草中進行外源表達時，ScFT2和去磷雙突變體ScFT2^S76A/T132A相對于游離GFP（對照）和其他ScFT2突變體饵隙，表現(xiàn)出持續(xù)促進煙草生長（圖6e）撮珠。與GFP相比，ScFT2和三個去磷突變體（ScFT2^S76A癞季、ScFT2^T132A及ScFT2^S76A/T132A）的異位表達提高了開花植株的百分比劫瞳，ScFT2^S76A/T132A尤其明顯，但在表達三個擬磷突變體（ScFT2^S76D, ScFT2^T132D, or ScFT2^S76D/T132D）中沒有觀察到這種促進作用（圖6f）绷柒。免疫印跡分析表明志于，ScFT2、ScFT2^S76A废睦、ScFT2^T132A和ScFT2^S76A/T132A在煙草植株中的積累量相當高伺绽，但ScFT2^S76D、ScFT2^T132D和ScFT2^S76D/T132D在煙草植株中的積累量卻很低（圖6g）嗜湃。因此奈应，保守的S76和T132殘基的改變影響了ScFT2控制植物開花的功能，這與ScFT2蛋白穩(wěn)定性的改變有關(guān)购披。本研究首次發(fā)現(xiàn)FT磷酸化對開花時間控制的影響杖挣，為更全面地探索FT蛋白控制植物開花的分子和生化機制提供了新的途徑。

作者進一步研究了光周期Photoperiod（Ppd）基因的表達刚陡，該基因在長日照條件下正調(diào)控FT的表達惩妇。在威寧和荊州黑麥的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)了一個表達Ppd的基因ScPpd1（ScWN2R01G043000）株汉。該基因在威寧黑麥內(nèi)的表達非常早，在播種2 天后達到表達高峰歌殃；而荊州黑麥在播種4天后才達到高峰（圖6h）乔妈。根據(jù)ScPpd1對黑麥抽穗期的調(diào)控作用，研究者利用威寧×荊州F2代群體氓皱，檢測到與前期研究一致的三個主效抽穗期QTL（Hd2R路召、Hd5R和Hd6R）。

圖6 威寧黑麥早期抽穗性狀的發(fā)育及基因表達特征

8.黑麥馴化過程中染色體區(qū)域和基因座的挖掘波材。

對馴化基因的分析可以促進對作物性狀的理解和改良股淡，但在黑麥中這類基因的分子分析方面進展甚微。作者通過全基因組選擇清除分析各聘，利用在栽培黑麥和瓦維洛夫黑麥（S. vavilovii）之間鑒定的123647個SNPs揣非，挖掘黑麥馴化相關(guān)染色體區(qū)域和基因座。DRI躲因、F_ST早敬、XP-CLR分析中，共同識別到11個選擇信號（圖7a-c）大脉。通過與水稻和大麥的共線性比較搞监，發(fā)現(xiàn)了一些可能的選擇清除位點，包括已在水稻或大麥中已被功能分析的ScBC1镰矿、ScBtr琐驴、ScGW2、ScMOC1秤标、ScID1和ScWx的同源基因（圖7a-c）绝淡。

檢測到的ScID1基因座包含一對具有相同編碼序列的ScID1同源序列（ScWN6R01G057200和ScWN6R01G057300，下稱ScID1.1和ScID1.2）（圖7d）苍姜。ScID1.1和ScID1.2蛋白與玉米ID1（63.19%）和水稻RID1（65.34%）具有很強的同源性牢酵，這兩個蛋白在玉米和水稻中都被發(fā)現(xiàn)調(diào)控著從營養(yǎng)體向花發(fā)育的轉(zhuǎn)換。ScID1.1和ScID1.2在威寧黑麥幼葉中的表達水平高于荊州黑麥（圖7e）衙猪。在威寧×荊州分離的F2群體中馍乙，ScID1^JZ/JZ純合植株的平均抽穗期顯著晚于ScID1^JZ/WN或ScID1^WN/WN個體（圖7f），這與荊州黑麥相對于威寧黑麥的晚花表型相一致（圖6a）垫释。以上結(jié)果表明ScID1可能參與了抽穗期的調(diào)控丝格，并可能通過黑麥馴化進行選擇，使作物成熟度得到適當?shù)恼{(diào)整棵譬，以更好地適應(yīng)生長環(huán)境显蝌。

圖7 黑麥馴化相關(guān)染色體區(qū)域和位點的鑒定與分析

總結(jié)

本研究對我國栽培的優(yōu)良品種威寧黑麥進行了基因組測序，基因組組裝大小為7.74 Gb订咸，其中93.67%被掛載到7條染色體上曼尊，重復(fù)序列占總基因組的90.31%扭屁。并基于高質(zhì)量基因組揭示了全基因組基因復(fù)制及其對淀粉生物合成基因的影響，解析了復(fù)雜儲存蛋白基因座位點涩禀、早抽穗性狀的基因表達特征以及黑麥中與馴化相關(guān)的染色體區(qū)域和基因座。本次研究結(jié)果對黑麥的基因組特性及其農(nóng)藝性狀調(diào)控基因有了新的認識然眼，獲得了對進一步研究黑麥馴化遺傳基礎(chǔ)可能有用的染色體區(qū)域和基因座艾船。威寧黑麥基因組組裝對于破解黑麥基因組生物學，深化比較谷類基因組學研究高每，加速黑麥及相關(guān)谷類作物的遺傳改良具有重要價值屿岂。

A high-quality genome assembly highlights rye genomic characteristics and agronomically important genes

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