一、真核生物mRNA的結構：
二庙曙、建庫方式：
真核生物mRNA含有poly-A尾陶缺，因此最常用的富集真核生物mRNA的方法就是采用附著poly-T oligo的磁珠從total RNA 中抓取mRNA务傲。建庫示意圖如下圖所示：
1履羞、提取總RNA：提取總RNA后需要對其進行質量檢查，包括純度茂契、濃度和完整性（RIN）蝶桶。如果總RNA起始量太低，不能保證有足夠的mRNA用于建庫掉冶。另外RNA容易降解真竖，而采用附著poly-T oligo的磁珠捕獲降解后的RNA會產(chǎn)生3'偏好性，因此建議RIN值大于等于7郭蕉。
2疼邀、mRNA捕獲：真核生物的成熟mRNA帶有poly-A尾，因此可以采用附著poly-T oligo的磁珠從總RNA中捕獲mRNA召锈。
3旁振、mRNA片段化：
4、cDNA第一鏈合成：以mRNA為模板合成cDNA涨岁。
5拐袜、cDNA第二鏈合成：以cDNA第一鏈為模板合成cDNA第二鏈。
6梢薪、雙鏈cDNA末端修復：3'加A蹬铺，5'修復。
7秉撇、加接頭：
8甜攀、PCR富集mRNA文庫。
9琐馆、上機測序规阀。
三、生信分析：
1瘦麸、數(shù)據(jù)拆分：利用bcl2fastq軟件將bcl文件轉換成fastq文件谁撼。
2、數(shù)據(jù)預處理：有些測序reads可能包含測序接頭滋饲、引物序列厉碟、低質量堿基、N含量較高屠缭，因此通常需要對測序數(shù)據(jù)進行預處理箍鼓，去除這些不合格的堿基或reads。常用的軟件有fastp呵曹，cutadpater以及Trimmonmatic等袄秩。
3、質控分析：對預處理后的數(shù)據(jù)進行質控分析，通常采用fastqc之剧。
4郭卫、參考基因組比對：將測序數(shù)據(jù)與參考基因組進行比對，常用的比對軟件有hisat2背稼，tophat2贰军，STAR等。
5蟹肘、轉錄本的組裝和定量：常用的軟件有cufflinks词疼，stringtie等。
6帘腹、差異分析：分析不同處理條件下基因或轉錄本的表達是否有差異贰盗，穿能夠與的軟件有DEseq2，edger阳欲，ballgown等舵盈。
7、富集分析：對差異基因進行富集分析球化，統(tǒng)計學原理是基于超幾何分布秽晚。
