Selective?targeting?of?engineered?T cells?using?orthogonal?IL-2?cytokine-receptor?complexes吝秕，if=37.205裳凸，Science.?2018 Mar 2;359(6379):1037-1042. doi: 10.1126/science.aar3246

背景

有兩個(gè)關(guān)于IL-2的故事盹憎，一個(gè)是腫瘤研究中制作移植瘤的大鼠動(dòng)物模型：NOD/SCID/IL2γ null mouse牡辽，其中將大鼠X染色體上的IL-2受體的γ鏈雙敲除思劳，該基因敲除之后呆细，大鼠免疫力嚴(yán)重降低侨嘀，成為制作移植瘤成功率最高的動(dòng)物模型臭挽。另外一個(gè)是，肝臟移植術(shù)中使用舒萊預(yù)防急性排斥反應(yīng)咬腕，舒萊又稱巴利惜單抗欢峰，其針對(duì)的抗原是CD25，而CD25蛋白是IL-2受體的組成部分。急性排斥反應(yīng)是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)纽帖，IL-2作用于T細(xì)胞表面的IL-2R宠漩，可以促進(jìn)T細(xì)胞的活化增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫的殺傷作用懊直。舒萊可以阻斷IL-2R哄孤，抑制T細(xì)胞的活化增生，從而抑制急性排斥反應(yīng)吹截。本研究是IL-2在增強(qiáng)腫瘤免疫中的作用的應(yīng)用瘦陈。

另外本研究是關(guān)于CAR-T腫瘤免疫治療的內(nèi)容。chemeric antigen receptor T cell immunotherapy嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療波俄，簡(jiǎn)單來說晨逝，將腫瘤患者的T細(xì)胞提取，體外通過基因工程改造懦铺，使得T細(xì)胞表面表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原受體捉貌，然后再回輸至患者體內(nèi)，這些T細(xì)胞將識(shí)別腫瘤細(xì)胞冬念，發(fā)揮細(xì)胞免疫殺傷作用趁窃。第一代CAR-T由于主要問題是：回輸入體內(nèi)后，不久CAR-T就逐漸死亡或凋亡消耗掉了急前，治療持續(xù)時(shí)間短醒陆。于是有人想法在T細(xì)胞表面加入一些共刺激因子，讓其在體內(nèi)可以接受刺激裆针，促進(jìn)其活化增殖刨摩，以便提供持續(xù)動(dòng)力。其中包括IL-2R世吨，就是一類共刺激分子澡刹，可以增強(qiáng)CAR-T的存活和功能。但是IL-2作用比較廣泛耘婚，CAR-T和IL-2共同輸入罢浇，副反應(yīng)太大。本研究即解決上述矛盾沐祷。

本研究的科學(xué)假設(shè)：同時(shí)改造CAR-T的共刺激受體IL-2R和輸入的IL-2嚷闭，使得只有改造的IL-2和CAR-T的IL-2R結(jié)合，而不與體內(nèi)其他細(xì)胞表面的IL-2R結(jié)合戈轿，也就不會(huì)產(chǎn)生相關(guān)副作用了凌受。

如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

肯定得需要?jiǎng)游锬Ｐ蛯?shí)驗(yàn)，制作移植瘤模型思杯，給予CAR-T免疫治療胜蛉，然后分成兩組挠进，分別給予普通IL-2和orthognal IL-2，觀察評(píng)價(jià)治療療效誊册、副反應(yīng)领突。療效評(píng)價(jià)可以選用瘤體大小、腫瘤生長(zhǎng)等指標(biāo)案怯。IL-2輔助免疫治療的副反應(yīng)如何評(píng)價(jià)君旦？需要知道我們臨床常見的副反應(yīng)是什么，根據(jù)不良反應(yīng)再來選擇檢測(cè)指標(biāo)嘲碱。

除了動(dòng)物模型的表象功能之外金砍，尚需要深入的分子互作研究。普通IL-2的分子互作機(jī)制什么麦锯？基因工程改造之后的orthognal IL-2能否與IL-2R結(jié)合恕稠，如何評(píng)價(jià)？orthognal IL-2和其他作用細(xì)胞共培養(yǎng)扶欣，檢測(cè)哪些常規(guī)細(xì)胞因子鹅巍，評(píng)價(jià)其不能引起相關(guān)副作用？

1料祠、IL-2在體內(nèi)的活性如何評(píng)估骆捧？

Stimulation of orthoIL-2Rb T cells (fig. S5B) with orthoIL-2 1G12 resulted in dose-dependent phosphorylation of STAT5 (pSTAT5), a hallmark of IL-2R signaling, with potency similar to that of wild-type IL-2, but also induced pSTAT5 on wild-type T cells, albeit with significantly reduced potency relative to IL-2。

The transcriptionfactor STAT5 is phosphorylated uponIL-2 engagement with the IL-2R and translocatesto the nucleus, where it promotes the proliferationand cell cycle progression of T cells髓绽。

IL-2 is indispensable for the development andfunction of regulatory T cells (Tregs) (12), whichare sensitive to IL-2 as a result of constitutiveexpression of CD25 and require IL-2Rb–dependentactivation of STAT5 signaling for survival andfunction (13)

IL-2刺激T細(xì)胞表面的IL-2Rβ敛苇，經(jīng)過信號(hào)傳導(dǎo)，引起細(xì)胞內(nèi)STAT5的磷酸化梧宫，通過檢測(cè)pSTAT5的表達(dá)水平接谨，評(píng)估IL-2的生物學(xué)功能強(qiáng)弱。

經(jīng)過突變途徑塘匣，篩選出1G12和3A10兩個(gè)突變體，具有和orthoIL-2R結(jié)合的功能巷帝，進(jìn)一步驗(yàn)證他兩能否刺激激活ortho T細(xì)胞和WT t細(xì)胞忌卤。其中3A10可以激活ortho T細(xì)胞，而不激活WT T細(xì)胞楞泼。

體外實(shí)驗(yàn)如何檢測(cè)IL-2對(duì)CD8+ T細(xì)胞的作用

?We explored the in vitro activity of orthoIL-2 on activated primary mouse CD8+ T cells engineered to express the orthoIL-2Rb and a yellow fluorescent protein (YFP) to distinguish modified (YFP+) andunmodified(YFP–) cells驰徊。

IL-2和CD8+T細(xì)胞表面的IL-2R結(jié)合后，刺激細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子STAT5磷酸化堕阔，激活下游通路棍厂，刺激細(xì)胞增生和細(xì)胞周期的前進(jìn)。野生型IL-2超陆、改裝orthoIL-2（1G12和3A10）分別對(duì)野生型CD8+ T和改裝orthoIL-2β的CD8+ T細(xì)胞作用牺弹，驗(yàn)證改裝的orthoIL-2只對(duì)改裝的T細(xì)胞有作用浦马，而對(duì)野生型無作用。

3個(gè)因子作用于兩種細(xì)胞张漂，分別從STAT5的磷酸化晶默、細(xì)胞生長(zhǎng)兩方面評(píng)價(jià)IL-2的功能作用。EC50為半數(shù)有效濃度航攒。改裝的IL-2 1G12可以同時(shí)刺激野生型和改裝型磺陡，但是3A10至刺激改裝型細(xì)胞。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)如何評(píng)估IL-2功能漠畜，它對(duì)機(jī)體免疫功能又什么影響（副作用）

?we determined the in vivo activity of orthoIL-2 and orthoIL-2Rb T cells in mice with intact immune systems.

制作黑色素瘤的動(dòng)物模型（本部分主要探討IL-2治療的副作用币他，所以沒有制作腫瘤動(dòng)物模型，而是選用的品系穩(wěn)定的BL6小鼠模型）憔狞，分別過繼輸入野生型CD8+T和改裝orthoIL-2Rβ的CD8+T細(xì)胞（論文中為mixture of wild-type and orthoIL-2Rβ CD8+ T cells）圆丹，然后分別輸入IL-2和ortho IL-2，觀察兩種IL-2分別對(duì)兩種過繼CD8+ T的影響躯喇。

動(dòng)物模型辫封，C57/BL6小鼠屬于近交品系，品系穩(wěn)定和易于繁殖廉丽。從Thy1.1從提取CD8+ T細(xì)胞倦微，然后過繼輸注于Thy1.2狗热，輸注細(xì)胞為mixture蹂窖。之后的0-4天，每天給予兩次IL-2或orthoIL-2语泽，第5天取小鼠的脾臟血焦履。

5天后取受體脾臟血液拓劝，評(píng)價(jià)受體中存活的供體CD8+ T細(xì)胞數(shù)量。發(fā)現(xiàn)常規(guī)IL-2和野生型CD8+ T細(xì)胞在過繼后很快消耗嘉裤，而改裝過的ortho IL-2和ortho IL-2Rβ組郑临，可以維持CD8+T數(shù)量在一個(gè)高水平。

B圖中 橫坐標(biāo)ortho表示ortho IL-2R β的CD8+ T細(xì)胞屑宠，wild-type表示未經(jīng)改裝的CD8+ T細(xì)胞厢洞。經(jīng)過IL-2刺激之后，過繼的CD8+ T能維持在較高水平典奉。

評(píng)價(jià)IL-2對(duì)機(jī)體免疫功能的影響躺翻，可以檢測(cè)受體小鼠脾臟重量以及脾臟內(nèi)CD8+ memory phenotype T cell、CD4+ Treg卫玖、和NK細(xì)胞數(shù)量的變化公你。CD8+ MP（ CD44+CD62L+）、CD4 Treg（CD25+Foxp3+）假瞬、NK （(CD3-NK1.1+CD49b+）陕靠。發(fā)現(xiàn)注射野生IL-2迂尝，對(duì)機(jī)體免疫功能影響很大。

外源性IL-2對(duì)小鼠免疫功能的影響懦傍，發(fā)現(xiàn)注射常規(guī)IL-2后雹舀，小鼠脾臟增大、CD8+ MP粗俱、CD4 Treg和NK細(xì)胞活性都增強(qiáng)说榆，導(dǎo)致機(jī)體的各種副反應(yīng)。而注射改裝后的orthoIL-2寸认，對(duì)小鼠體內(nèi)三種細(xì)胞數(shù)量無明顯影響签财。H圖為典型流式圖，上圖為NK細(xì)胞偏塞，下圖為CD4 Treg唱蒸。

檢測(cè)受體小鼠體內(nèi)IFN、IL-5灸叼、血小板計(jì)數(shù)神汹；同樣反應(yīng)IL-2對(duì)機(jī)體的影響；另外從宏觀水平上古今，可以觀察注射IL-2之后小鼠生存率屁魏、體重變化等方面評(píng)價(jià)IL-2的療效。

MSA：mouse serum albimin小鼠血清白蛋白捉腥，將IL-2和小鼠白蛋白結(jié)合注射后氓拼，IL-2的半衰期更長(zhǎng)。所有上述圖表都反映出：常規(guī)IL-2注射后抵碟，小鼠死亡率增加桃漾、體重下降、血小板減少拟逮、IFN和IL-5產(chǎn)生增多撬统。而改造的ortho IL-2則不會(huì)誘發(fā)那么多副反應(yīng)。

動(dòng)物模型證實(shí)唱歧，改裝的orthoIL-2/IL-2Rβ具有治療作用

上一部分是證實(shí)傳統(tǒng)IL-2注射后宪摧，對(duì)機(jī)體的副反應(yīng)很大，用于臨床患者不能耐受IL-2誘導(dǎo)的副反應(yīng)颅崩，而作者改裝的orthoIL-2/IL-2β則不會(huì)誘導(dǎo)副反應(yīng)。本部分需要證實(shí)改裝的orthoIL-2具有抗腫瘤效應(yīng)蕊苗。需要制作黑色素瘤的動(dòng)物模型（B6-F10 mouse model of melanoma沿后，B6-F10黑色素瘤細(xì)胞皮下注射C57BL/6J小鼠）。

首先評(píng)價(jià)過繼T細(xì)胞分泌IFN-γ和細(xì)胞表面PD-1/TIM-3的表達(dá)水平變化朽砰，因?yàn)槟芊置贗FN-γ的過繼T細(xì)胞更具殺傷力尖滚，而PD-1和TIM-3與過繼T細(xì)胞的殺傷力呈反比喉刘。可以發(fā)現(xiàn)改裝orthoIL-2可以刺激過繼T細(xì)胞分泌IFN-γ漆弄，而不明顯提高TIM-3的表達(dá)睦裳。

給予IL-2后，過繼T細(xì)胞表面IFN-γ增多撼唾，殺傷力增強(qiáng)廉邑。但是IL-2同樣升高免疫剎車蛋白PD-1和TIM-3的表達(dá)。但是改裝的orthoIL-2則不導(dǎo)師免疫剎車TIM-3的高表達(dá)倒谷，說明它不抑制免疫殺傷蛛蒙。

宏觀水平，從移植瘤生長(zhǎng)速度和移植瘤小鼠生存率兩個(gè)指標(biāo)觀察治療療效渤愁。

傳統(tǒng)過繼T細(xì)胞+IL-2治療腫瘤生長(zhǎng)快牵祟、死亡率高。而使用改裝orthoIL-2或者雙改裝抖格，腫瘤生長(zhǎng)更慢诺苹，小鼠死亡率較低。治療效果好雹拄。

過繼T細(xì)胞的制作問題

本論文最后一部分收奔，是針對(duì)過繼T細(xì)胞對(duì)黑色素瘤治療療效的評(píng)價(jià)。那么如何產(chǎn)生針對(duì)黑色素留的過繼T細(xì)胞呢办桨？

Transgenic pmel-1 T cell receptor (TCR) cells (pmel-1 T cells) express a high-affinity TCR that recognizes the B16-F10 specific ortholog of human gp100 (19), a self antigen overexpressed in human melanoma筹淫。

黑色素瘤表達(dá)gp100抗原，制作識(shí)別pmel-1的TCR的CD8+ T細(xì)胞呢撞，可以識(shí)別黑色素瘤細(xì)胞损姜，進(jìn)而殺滅瘤細(xì)胞。B16-F10是小鼠黑色素瘤細(xì)胞系殊霞，可以皮下種植與C57BL/6J小鼠形成移植瘤摧阅。orthoIL-2Rβ pmel1 transgenic CD8+ Tcells：利用轉(zhuǎn)基因制作的針對(duì)B6-F10黑色素瘤細(xì)胞抗原gp100的TCR 殺傷T細(xì)胞。