植物免疫系統(tǒng)可以抵御病原體并預(yù)防疾病虹蓄。該系統(tǒng)特別使用通常表現(xiàn)出抗菌活性或免疫調(diào)節(jié)活性的防御肽“苊鳎抗菌肽 (AMP) 具有靶向并直接殺死微生物的細(xì)胞毒性活性歌殃，而免疫調(diào)節(jié)肽（也稱為類似于后生動物細(xì)胞因子的植物細(xì)胞因子）通過與特定細(xì)胞表面受體結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫信號傳導(dǎo) 。

在動物中辞嗡，迄今為止描述的大多數(shù)防御肽都是雙功能的捆等，即它們表現(xiàn)出抗菌（或更廣泛地說是殺菌，即直接殺死入侵的細(xì)菌）和免疫調(diào)節(jié)活性续室。這些肽被稱為宿主防御肽（HDP）栋烤，并作為具有高增值潛力的分子出現(xiàn)，因?yàn)樗鼈兊脑S多活性可用于治療目的挺狰。

在植物中班缎，僅描述了少數(shù) HDP 候選物，并且在免疫系統(tǒng)中具有兩種不同作用的防御肽的概念最近才出現(xiàn)她渴。

2023年11月27日译蒂，bioRxiv發(fā)表了Benjamin Petre團(tuán)隊(duì)題為“Genetically-clustered antifungal phytocytokines and receptor proteins function together to trigger plant immune signaling”的研究論文曼月。該論文提出楊樹銹誘導(dǎo)肽PtRISP1在楊樹中表現(xiàn)出誘導(dǎo)子活性谊却，且對楊樹銹菌有直接抗菌活性，還明確了植物中第一個能夠識別抗菌肽（AMP）的LRR-RP蛋白受體RALR哑芹。https://doi.org/10.1101/2023.11.27.568785

楊柳科植物重新分為兩個主要屬：楊屬（楊樹）和柳屬（柳樹）炎辨。Populus trichocarpa是第一種對其基因組進(jìn)行測序的樹木（2006年）。

2007年聪姿，楊樹葉的轉(zhuǎn)錄組分析揭示了一個名為銹誘導(dǎo)分泌肽（RISP碴萧，以下更名為PtRISP1）的孤兒基因，它是對銹病病原體感染的有效免疫反應(yīng)過程中誘導(dǎo)最多的基因末购。

PtRISP1 是陽離子的破喻、熱穩(wěn)定的，其成熟形式由 60 個氨基酸組成招盲，并分泌到本塞姆氏煙草的質(zhì)外體中低缩。純化的肽在體外和楊樹上直接抑制落葉松花楊的生長，并引發(fā)楊樹細(xì)胞培養(yǎng)物堿化曹货。

PtRISP1基因位于LRR-RP基因旁邊（RISP-ASSOCIATED LRR-RP 咆繁；PtRALR ），并且這兩個基因在生物或非生物脅迫響應(yīng)中共同調(diào)節(jié)顶籽，表明它們的產(chǎn)物之間存在功能聯(lián)系玩般。

就是說需要考慮兩個問題：

• 1 評估楊柳科RISP和RALR基因家族的多樣性和進(jìn)化。

• 2 RALR 是否識別 RISP 來激活免疫信號礼饱。

基本結(jié)論：RISP和RALR基因?qū)儆谠跅顦浜土鴺渲袑ｉT進(jìn)化為簇的基因家族坏为，并且來自楊樹和柳樹的兩個不同的 RISP/RALR 對共同發(fā)揮作用，觸發(fā)免疫信號傳導(dǎo)镊绪。

RISP和RALR基因簇在楊柳科中特異進(jìn)化

為了確定 PtRISP1 是否屬于某個基因家族匀伏，我們在公開的預(yù)測蛋白質(zhì)組中全面搜索了 PtRISP1 同源物。搜索總共在 7 個楊柳科物種的 8 個不同基因組中鑒定出了 24 個此類同源物（以下簡稱 RISP）（數(shù)據(jù)集 S2）蝴韭。這 24 個RISP基因?qū)儆?9 號染色體所包含的 8 個簇够颠，每簇包含 2 至 4 個基因（每個基因組一個簇）；除了P. trichocarpa之外榄鉴，它呈現(xiàn)出兩個簇（第二個簇存在于小支架 502 上）履磨。24 個 RISP 家族成員的大小從 76 到 83 個氨基酸不等（成熟形式為 50 到 58 個氨基酸），并且表現(xiàn)出 68% 的平均百分比同一性（圖1a ）庆尘。

我們在楊樹和柳樹之外沒有發(fā)現(xiàn) RISP剃诅，這表明 RISP 家族是在楊柳科物種中專門進(jìn)化的。系統(tǒng)發(fā)育分析表明驶忌，楊樹和柳樹 RISP 分為兩個得到充分支持的系統(tǒng)發(fā)育分支矛辕，這表明該家族是從一個單一祖先基因進(jìn)化而來的，該基因出現(xiàn)在楊樹和柳樹的祖先物種中。6000萬年前（圖1a）如筛。

RISP 預(yù)測的信號肽高度保守（平均 p 距離為 0.158 ± 0.11）堡牡，而 RISP 成熟形式差異更大（平均 p 距離為 0.458 ± 0.18）。盡管存在這種序列變異性杨刨，RISP 成熟形式仍具有 4 個具有顯著且保守特性的區(qū)域：

i) 具有預(yù)測的 α 螺旋結(jié)構(gòu)的 N 末端區(qū)域晤柄，

ii) 親水區(qū)域，

iii) 帶正電區(qū)域（正電荷的平均凈電荷） 6 ± 1.6)

iv) C 端負(fù)電荷區(qū)域（平均凈電荷為負(fù) 2.7 ± 0.8）（圖1a妖胀；數(shù)據(jù)集 S2）芥颈。

此外，RISP 在其成熟形式中具有四個完全保守的半胱氨酸赚抡，并呈現(xiàn)出較高的預(yù)測等電點(diǎn)（平均值為 9.4 ± 0.3）（圖1a）爬坑。總而言之涂臣，這些結(jié)果表明 RISP 作為簇進(jìn)化盾计，特別是最近在楊柳科物種中，形成了一個多樣化的陽離子分泌肽家族赁遗。

為了評估PtRALR在LRR-RP基因家族中如何進(jìn)化署辉，我們在公開的預(yù)測蛋白質(zhì)組以及 NCBI 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中全面搜索了 PtRALR 同源物⊙宜模總共哭尝，該搜索僅識別出屬于 10 個不同楊柳科物種的 25 個此類同源物（以下簡稱 RALR）（文本文件 S1）。

所有 RALR 都聚集在 LRR-RP 系統(tǒng)發(fā)育樹內(nèi)的一個完全分離的進(jìn)化枝（以下簡稱 RALR 進(jìn)化枝）中剖煌；RALR 進(jìn)化枝本身存在于楊柳科 LRR-RP 的一個大進(jìn)化枝中材鹦。在 RALR 進(jìn)化枝內(nèi)，柳樹序列聚集成一個單獨(dú)的子進(jìn)化枝（圖1b）耕姊。

有趣的是桶唐，在 25 個 RALR 中，有 8 個源自 Phytozome 門戶上存在的 8 個楊柳科基因組茉兰；這 8 個RALR基因都位于RISP簇內(nèi)莽红，緊鄰RISP基因的下游（圖1d；數(shù)據(jù)集 S3）邦邦。

因此，迄今為止在可用的楊柳科基因組中鑒定的所有RISP和RALR基因都聚集在一起醉蚁，使得這些簇包含一個RALR基因和兩到四個RISP基因燃辖。總體而言网棍，這些發(fā)現(xiàn)表明黔龟，包含RISP和RALR基因的簇從楊柳科物種的共同祖先簇進(jìn)化并多樣化。

SpRISP1 和 PtRISP1 表現(xiàn)出相似的生物物理特性和抗菌活性

共聚焦顯微鏡分析表明SpRISP1和PtRISP1（用作陽性對照）僅在質(zhì)外體中積累，而不與游離GFP（用作核質(zhì)標(biāo)記）的信號重疊（圖2a ）氏身。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示巍棱，本塞姆氏煙草葉子的質(zhì)外體液中存在 RISP-mCherry 融合體和 SP-Ramya3A-mCherry（質(zhì)外體對照），而細(xì)胞內(nèi) GFP 僅在總?cè)~蛋白提取物中檢測到蛋欣。

SpRISP1純化蛋白在95℃熱處理10分鐘后仍然可溶航徙，類似于PtRISP1（圖2b）。

蛋白質(zhì)孢子下拉分析表明陷虎，與 PtRISP1（陽性對照）類似到踏，SpRISP1 附著在 urediniospore 上，而 GFP 陰性對照則不然（圖2c）尚猿。

發(fā)芽抑制實(shí)驗(yàn)表明窝稿，100 μM SpRISP1 溶液可抑制落葉松楊-楊樹孢子的發(fā)芽，與 PtRISP1 陽性對照類似（發(fā)芽率分別為 22 % ± 7 和 8.5 % ± 6）凿掂。模擬處理的發(fā)芽率高達(dá)85%±8（圖2d）伴榔。

PtRISP1 和 SpRISP1 屬于其家族的兩個主要且不同的亞支，這些發(fā)現(xiàn)表明 RISP 家族成員在整個進(jìn)化過程中保留了相似的生物物理特性和活性庄萎。

在本塞姆氏煙草中踪少，PtRALR 和 SpRALR 以 PtSOBIR1 依賴性方式積聚在質(zhì)膜上

PtRALR-GFP 或 SpRALR-GFP 融合體與 PtRISP1mCherry（用作質(zhì)外體標(biāo)記）和 P19 蛋白（沉默抑制子）在葉細(xì)胞中共表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外圍有微弱的 GFP 信號惨恭，該信號與 mCherry 信號不重疊（圖3）秉馏。值得注意的是，RALR-GFP 融合體的積累需要 P19 蛋白的存在脱羡，因?yàn)槲覀冊跊]有 P19 的測定中觀察不到熒光信號萝究。這些初步結(jié)果表明 RALR-GFP 融合體可以在本塞姆氏煙草中積累，但水平較低锉罐，這妨礙了進(jìn)一步的功能分析帆竹。

考慮到SOBIR1 的存在被證明有助于植物細(xì)胞中 LRR-RP 的積累。于是克隆了 PtSOBIR1脓规，正如預(yù)期栽连，PtSOBIR1 促進(jìn)了 RALR-GFP 融合物在質(zhì)膜上的積累，因?yàn)槲覀兛梢栽跊]有 P19 的情況下觀察到 GFP 信號侨舆∶虢簦總之，這些結(jié)果表明 PtRALR 和 SpRALR 都可以在本塞姆氏煙中積聚在質(zhì)膜上挨下，并且 PtSOBIR1 的存在促進(jìn)了這種積聚熔恢。由于沒有檢測到細(xì)胞死亡或葉片應(yīng)激癥狀，我們推測瞬時測定適合研究 RALR 介導(dǎo)的免疫信號激活臭笆。

純化的 RISP 在本塞姆氏煙草中以 RALR 依賴性方式觸發(fā)免疫信號傳導(dǎo)

另一方面茂洒，用 SpRISP1/SpRALR 對進(jìn)行的相同實(shí)驗(yàn)顯示孟岛，ROS 和磷酸化 MAPK 的積累較弱，盡管兩者都顯示出短暫的積累模式获黔。

總而言之蚀苛，我們得出結(jié)論，本塞姆氏煙草葉子中 RALR 和 PtSOBIR1 的共表達(dá)賦予了 RISP 響應(yīng)性玷氏，表明 PtRALR 和 SpRALR 分別識別 PtRISP1 和 SpRISP1堵未，并且這種識別快速啟動免疫信號事件。

純化的 PtRISP1 觸發(fā)楊樹氣孔關(guān)閉

PtRISP1 的外源處理會觸發(fā)快速而強(qiáng)烈的氣孔關(guān)閉盏触，表明 PtRISP1 足以在楊樹葉中引發(fā)免疫相關(guān)反應(yīng)渗蟹。

展望

后生動物宿主防御肽的植物功能類似物的表征成為研究前沿

基因聚類分析可以幫助識別候選配體/受體對嗎？

篩選基因組中編碼細(xì)胞表面受體和小分泌蛋白的物理關(guān)聯(lián)和共同調(diào)節(jié)的基因可能有助于加速配體/受體對候選物的識別赞辩。

表征非模式物種的 LRR-RP 需要付出巨大的努力來獲得全基因組家族知識雌芽、生產(chǎn)分子材料并實(shí)施方法

RALR 是第一個被報(bào)道可識別植物細(xì)胞因子的 LRR-RP

參考資料

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