隨著測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用的普及舔痪，研究者們在拿到大量的測序結(jié)果后，面臨的困擾是怎樣選擇合適的結(jié)果驗證策略。在這里嗜逻，我們一起來了解一下高分文章中有哪些熱門的驗證方法吧咪鲜，總有一種適合你。
Sanger
Sanger 測序原理（圖1）[1]：選擇的 DNA 序列是用一個測序反應(yīng)制備的滋捶，其中脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）與終止的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）結(jié)合痛悯。每個鏈末端的核苷酸都用堿基特有的顏色標(biāo)記。測序反應(yīng)生成所有長度的片段重窟，可以使用凝膠或毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離载萌，其中標(biāo)記的堿基顯示每個位置的序列信息。讀長度約為700bp。
結(jié)果圖解：
RT-qPCR
定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是定量監(jiān)測某種RNA的一種試驗方法。在該方法中顽分，總 RNA 或信使 RNA（mRNA）首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ) DNA（cDNA）徐许。再以 cDNA為模板進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳怯邪，確認(rèn)RT-PCR 反應(yīng)產(chǎn)物绊寻。RT-qPCR 已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括基因表達(dá)分析悬秉、RNA 干擾驗證澄步、微陣列驗證、病原體檢測和泌、基因測試和疾病研究村缸。
結(jié)果圖解：?
WGS 和 WES 結(jié)果分析武氓，發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺動脈高壓新的易感基因PTGIS?c.521 + 1G> A梯皿。為了驗證其是否對PTGIS?基因轉(zhuǎn)錄本有影響，利用RT-qPCR檢測到突變型（VAR）PTGIS?基因產(chǎn)生2個不同轉(zhuǎn)錄本县恕，1條短且暗的條帶（VAR-1）和1條長且亮的條帶（VAR-2）东羹。
對 qPCR 產(chǎn)物 Sanger 測序（圖3，右圖）忠烛，揭示 VAR-1是內(nèi)含子4區(qū)371bp被包含属提，提前終止翻譯，導(dǎo)致 PTGIS 蛋白質(zhì)功能不全美尸。VAR-2 測序顯示外顯子4整個區(qū)域被刪除冤议，導(dǎo)致48個氨基酸片段缺失（p.Thr127_Arg174del）。
綜合可知师坎，RT-qPCR 和 Sanger 測序表明PTGIS?c.521 + 1G> A 變異位點導(dǎo)致PTGIS?的 mRNA 轉(zhuǎn)錄異常恕酸。
Western-Blot
免疫印跡法（Western blotting, Western-Blot）原理是蛋白所帶分子量不同在凝膠電泳中產(chǎn)生不同的電泳速度而被分離。轉(zhuǎn)移固相到PVDF 膜或 NC 膜上胯陋。以固相中的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原蕊温，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)袱箱，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分寿弱。該方法廣泛應(yīng)用于基因組在蛋白水平的表達(dá)研究犯眠。
結(jié)果圖解：
WES 關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺動脈高壓（IPAH）新的易感基因BMP9症革，為了驗證BMP9?突變導(dǎo)致的有害結(jié)果筐咧，選擇BMP9?的6個突變進(jìn)行功能評估（S282fs 為截斷突變，其余5個均為錯義突變)噪矛。Western-Blot 的結(jié)果表明5個錯義突變和野生型相比量蕊，pro-BMP9 蛋白水平的表達(dá)無明顯差異，但成熟 BMP9（25KDA）水平均顯著低于野生型（圖4A）艇挨；截斷變異 S282fs 并未檢出 pro-BMP9 和成熟 BMP9（圖4A残炮、B）。表明這些突變對 BMP9 合成和裝配有一定影響缩滨。
CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas 系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng)势就。某些細(xì)菌在遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲到自身的 DNA 里一個稱為 CRISPR 的存儲空間脉漏。當(dāng)再次遇到病毒入侵時苞冯，細(xì)菌能夠根據(jù)存寫的片段識別病毒，將病毒的 DNA切斷侧巨，沉默外源基因的表達(dá)舅锄。目前，被最為廣泛應(yīng)用的是 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)司忱，原理是在向?qū)?RNA（guide RNA, gRNA）和 Cas9 蛋白的參與下皇忿，待編輯的細(xì)胞基因組 DNA 將被看作病毒或外源 DNA，被精確剪切坦仍△⑺福可應(yīng)用于基因敲除，基因替換等基礎(chǔ)編輯方式繁扎，還可以被用于基因激活幔荒，疾病模型構(gòu)建，甚至是基因治療锻离。
斑馬魚模型
目前铺峭，斑馬魚已成為一種公認(rèn)的新型模式生物墓怀。斑馬魚體內(nèi)存在的人類同源基因比例高達(dá)87%汽纠，某些疾病相關(guān)基因與人類基因保守性高達(dá)99%, 這意味著在其身上做藥物實驗所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體,常被用來進(jìn)行遺傳病和腫瘤突變的功能驗證。
結(jié)果圖解：
文章中通過WES數(shù)據(jù)分析虱朵，發(fā)現(xiàn)含有UBA1?基因體細(xì)胞突變（p.Met41）的人莉炉，具有炎癥綜合癥的表型。UBA1?因轉(zhuǎn)錄起始位點的不同碴犬，有兩種亞型絮宁，UBA1a?和UBA1b。為了研究UBA1?亞型對炎性疾病的貢獻(xiàn)服协，我們建立了CRISPR-Cas9編輯斑馬魚模型作為體內(nèi)模型來評估基因功能绍昂。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與 control 對比，△uba1 和△uba1b 斑馬魚的中性粒細(xì)胞數(shù)量低于野生型斑馬魚（圖5A)偿荷、圖5B)）窘游，且導(dǎo)致了斑馬魚炎癥基因表達(dá)的上調(diào)（圖5，E）跳纳。綜上忍饰，敲除斑馬魚細(xì)胞質(zhì)UBA1?亞型同源物可引起全身炎癥。
小鼠模型
由于小鼠與人類的基因同源性高達(dá)78.5%寺庄，基因組93%的區(qū)域基因排列順序與人類相同艾蓝，生化指標(biāo)及調(diào)控機(jī)制和人類相似，小鼠模型已經(jīng)成為研究基因功能與致病機(jī)制斗塘、建立人相關(guān)疾病模型和評價研發(fā)藥物安全性與有效性等生物醫(yī)藥研究的重要模型赢织。
結(jié)果圖解：
文章中通過 scRNA 測序分析，發(fā)現(xiàn) NOTCH3?信號通路在血管周圍和 CD90(THY1)+?成纖維細(xì)胞分化起關(guān)鍵作用逛拱，這一步驟是炎癥性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）發(fā)展所必需的敌厘。為了驗證 NOTCH3 信號在 RA 中的作用機(jī)制，建立了小鼠模型（Notch3?/?小鼠模型和炎癥性關(guān)節(jié)炎小鼠模型（通過靜脈注射 K/BxN 小鼠混合血清誘導(dǎo)））朽合，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比俱两，Notch3?/?小鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎疾病指數(shù)顯著降低（p=3.01×10?16），腳爪腫脹顯著降低（p=5.02×10?14）(圖6 d, e)曹步。此外宪彩，每周兩次使用 NOTCH3拮抗抗體(anti-NRR3) 減輕了關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度（p=3.47×10?8）和關(guān)節(jié)腫脹程度（p=5.54×10?9）(圖6 f, g)。
該研究推進(jìn)了先前對 RA 中 NOTCH 信號的理解讲婚，為通過調(diào)節(jié) NOTCH3 信號來靶向治療 RA 提供了分子基礎(chǔ)尿孔。
結(jié)合不同的驗證目的，可將測序結(jié)果驗證方法分為準(zhǔn)確性驗證類筹麸、功能驗證類活合。Sanger 用于檢測突變的準(zhǔn)確性，RT-qPCR 常用于檢測突變導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況物赶，Western-Blot 可用于檢測突變對蛋白合成的影響白指。此外，還有 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)結(jié)合動物模型酵紫，可模擬活體內(nèi)突變導(dǎo)致的影響告嘲，常用的有斑馬魚模型错维、小鼠模型。大家可根據(jù)自己的需求結(jié)合各方法的優(yōu)劣勢來進(jìn)行選擇橄唬。
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