m6A甲基化是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中重要的表觀遺傳修飾方式，它普遍存在于病毒和真核生物中文狱。MeRIP-seq（高通量測(cè)序法）作為m6A修飾的檢測(cè)方法蝠咆，其具有針對(duì)全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)m6A的存在冰更；能夠明確每個(gè)基因的修飾水平啡邑，進(jìn)行組與組之間比較等優(yōu)勢(shì)贱勃。接下來就讓小編帶大家詳細(xì)了解m6A和MeRIP-seq。
1.在介紹m6A之前谣拣，首先認(rèn)識(shí)一下什么是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控？
轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(post-transcriptional control)是指在轉(zhuǎn)錄后水平(RNA)上對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控族展，包括對(duì)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行的一系列修飾和加工森缠。
轉(zhuǎn)錄后調(diào)控具體主要體現(xiàn)在：
1）對(duì)mRNA前體hnRNA的剪接和加工；例如5’-端加帽仪缸、3’-端polyA尾贵涵、RNA修飾、RNA剪接恰画。
2）mRNA由細(xì)胞核轉(zhuǎn)至細(xì)胞質(zhì)的過程及定位宾茂；
3）mRNA的穩(wěn)定性、降解拴还、翻譯過程等多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行的調(diào)控跨晴；
4）RNA編輯和RNA干擾等現(xiàn)象也屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
2.什么是m6A片林？
m6A甲基化修飾是指腺嘌呤的6號(hào)碳原子連接的氨基基團(tuán)中的一個(gè)氫被甲基基團(tuán)取代端盆，在m6A甲基化過程中涉及的這3類重要的酶：
①Writers怀骤，甲基化酶，催化m6A甲基化的發(fā)生焕妙；
②Erasers蒋伦，去甲基化酶：去除m6A甲基化的修飾；
③Readers焚鹊，m6A識(shí)別蛋白痕届，識(shí)別m6A修飾位點(diǎn)。
如下圖所示末患，m6A是動(dòng)態(tài)可逆的研叫。
Dominissini, D. et al.（2014）
3. m6A具有哪些生物學(xué)功能，以及應(yīng)用的領(lǐng)域阻塑？
m6A具有調(diào)控可變剪切蓝撇、調(diào)控mRNA出核轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控mRNA的選擇性翻譯和翻譯速率陈莽、相分離以及與RNA的穩(wěn)定性有關(guān)等功能渤昌。
m6A作為最常見的一種轉(zhuǎn)錄后修飾锈至，介導(dǎo)了超過80%的RNA甲基化奔穿。其調(diào)控機(jī)制與生物學(xué)功能涉及各個(gè)領(lǐng)域：
醫(yī)學(xué)：
1）癌癥：肺癌、肝癌缝其、等私植，研究的主要內(nèi)容包括m6A修飾如何影響腫瘤的發(fā)生忌栅、增殖、轉(zhuǎn)移曲稼、耐藥等索绪；
2）其它類疾病：心血管疾病贫悄，神經(jīng)性疾病瑞驱，代謝類疾病等；
3）胚胎發(fā)育等窄坦。
農(nóng)學(xué)：
研究的物種有果蠅唤反，斑馬魚，豬鸭津；擬南芥彤侍、玉米，水稻逆趋，番茄等盏阶。
4. MeRIP-seq的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)？
實(shí)驗(yàn)樣本：
細(xì)胞闻书、組織般哼、提取后的總 RNA（限定有參基因組物種）吴汪。
實(shí)驗(yàn)分組：
細(xì)胞模型：實(shí)驗(yàn)組VS對(duì)照組，建議3:3
組織模型：正常組VS疾病組蒸眠，建議5:5
組內(nèi)對(duì)照：IP組VS input組*
注*：input組主要用于比較鑒定IP組的抗體特異性結(jié)合漾橙，是必備的組分
測(cè)序平臺(tái)：NovaSeq
關(guān)鍵分析內(nèi)容：
m6A的基本特征
特征一. Peak在基因元件的分布
特征二. reads在基因元件的分布
特征三. Peak關(guān)聯(lián)基因的特征
5. MeRIP-seq的送樣要求？
? 樣本類型：細(xì)胞楞卡、組織霜运、total RNA
? 樣本要求：
?人、大鼠蒋腮、小鼠
常規(guī)MeRIP-seq：Dnase消化后RNA總量≥25μg淘捡，濃度≥100 ng/μg，RIN≥8池摧；
?非人非鼠物種
Dnase消化后RNA總量≥150μg焦除，濃度≥100 ng/μg，RIN≥8作彤。
注：
1）人膘魄、小鼠和大鼠可同時(shí)檢測(cè)mRNA和lncRNA上的m6A修飾，非人非鼠物種（人竭讳、小鼠创葡、大鼠以外的物種）只能檢測(cè)mRNA上的m6A修飾；
2）盡量提供RNA樣本绢慢；
3）如需公司進(jìn)行RNA提取灿渴，請(qǐng)根據(jù)樣本特性估算樣本量，最終獲得的RNA質(zhì)量和總量以質(zhì)檢結(jié)果為準(zhǔn)胰舆；
4）活體取樣骚露，剔除結(jié)締組織以及其它非研究組織，用預(yù)冷的PBS漂洗缚窿，去除血液和雜質(zhì)棘幸。體積較大的組織需切割成綠豆大小的小塊。將組織放入事先標(biāo)記好樣本信息的RNAase-free管中（管子速凍后無法做標(biāo)記）滨攻，立即液氮速凍2min够话，-80℃保存蓝翰。
6. MeRIP-seq建庫(kù)測(cè)序流程光绕？
MeRIP-seq技術(shù)包括MeRIP實(shí)驗(yàn)和測(cè)序兩個(gè)部分。
流程圖如下圖所示：
每組MeRIP-seq由兩種類型的樣本組成畜份，即immunoprecipitation（IP）樣本和Input對(duì)照樣本诞帐。RNA分子首先被片段化成約100-200nt的片段。通過抗m6A的特異性抗體爆雹，IP樣本提供了甲基化RNA片段的無偏測(cè)量停蕉。同時(shí)愕鼓，Input對(duì)照樣本可反映基礎(chǔ)RNA的豐度。通過建庫(kù)慧起、高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析菇晃，給出全轉(zhuǎn)錄組m6A的定位。
Fu, Y et al. (2014)
7. MeRIP-seq分析流程蚓挤？
測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)之后磺送，我們就可以獲得原始測(cè)序序列(Sequenced Reads)，在有相關(guān)物種參考序列或參考基因組的情況下灿意，我們通過如下標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行生物信息分析：
8. MeRIP-seq后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證估灿？
MeRIP-qPCR：利用m6A抗體在富集到帶甲基化修飾的RNA后，下一步使用qPCR直接對(duì)富集到的RNA進(jìn)行定量的一種技術(shù)缤剧。建議結(jié)合基因表達(dá)RT-qPCR 馅袁、WB等驗(yàn)證手段一起進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證。
9. m6A甲基化的研究思路荒辕？
典型的m6A研究的法則：
1）m6A測(cè)序前的預(yù)實(shí)驗(yàn)汗销，檢測(cè)RNA的m6A水平是否發(fā)生差異等；
2）m6A測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組學(xué)挖掘差異基因兄纺；
3）?后期功能驗(yàn)證大溜。
10. 相比其他m6A檢測(cè)方法，MeRIP-seq具有哪些優(yōu)勢(shì)估脆？
1钦奋、針對(duì)全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)m6A的存在；
2疙赠、m6A的檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)到基因水平付材；
3、能夠明確每個(gè)基因的修飾水平圃阳，進(jìn)行組與組之間比較厌衔；
4、檢測(cè)平臺(tái)為測(cè)序儀捍岳，儀器限制低富寿，通用性高，重復(fù)性好锣夹；
5页徐、結(jié)果可以和其他組學(xué)聯(lián)合分析，從多維度講述機(jī)制機(jī)理故事银萍；
6变勇、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，入門容易贴唇。
