雜志： Frontiers in Immunology

影響因子：5.7

研究概述：

作為抗腫瘤免疫的主要組成部分术羔，T細胞在腫瘤微環(huán)境（TME）中容易衰竭和發(fā)生功能障礙姑蓝。深入了解 TME 中的 T 細胞耗竭 （TEX） 對于在臨床環(huán)境中有效解決 TEX 問題和提高免疫檢查點阻斷療法的療效至關(guān)重要。在真核生物中锅移，許多細胞表面蛋白通過糖基磷脂酰肌醇 （GPI） 錨栓拴在質(zhì)膜上熔掺，這在促進膜蛋白的正確易位方面起著至關(guān)重要的作用。然而非剃，現(xiàn)有證據(jù)并不足以支持該結(jié)論置逻。該研究了乳腺癌（BC）患者TME中GPI-錨生物合成的特征，特別是其與TEX的相關(guān)性备绽。GPI-錨定生物合成應(yīng)被視為乳腺癌的預后危險因素券坞。GPI-錨定生物合成高的患者表現(xiàn)出更嚴重的TEX。耗竭的CD8 T細胞中GPI-錨定生物合成水平高于正常CD8 T細胞肺素，這在惡性上皮細胞和正常乳腺上皮細胞之間未觀察到恨锚。此外，作者還發(fā)現(xiàn)GPI-錨定生物合成相關(guān)基因可用于診斷BC患者的TEX狀態(tài)和預測預后倍靡，TEX診斷模型和預后模型均表現(xiàn)出良好的AUC值猴伶。最后，作者在細胞和臨床樣本中進一步證實，敲低 PIGU 基因表達可顯著降低 MDA-MB-231 和 MCF-7 細胞系的增殖率他挎。臨床樣本的免疫熒光結(jié)果顯示筝尾，GPAA1 和 PIGU 高表達的組織中 CD8 T 細胞聚集減少。

機器學習目前在腫瘤和非腫瘤生信中越來越常見雇盖，不管是構(gòu)建模型還是篩選關(guān)鍵基因忿等，都有很出色的發(fā)揮栖忠。想做類似分析的朋友崔挖，歡迎交流！

研究結(jié)果：

糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨生物合成是乳腺癌的預后危險因素

作者利用收集的GPI相關(guān)的基因庵寞，量化了具有 GPI 評分的患者 GPI 錨定生物合成的強度狸相，并評估了 TCGA 泛癌數(shù)據(jù)集中癌癥和癌旁組織之間 GPI 錨定生物合成的差異（圖1A）。根據(jù)森林圖（圖1B）所示的Unicox分析結(jié)果捐川，GPI錨定的生物合成是LGG脓鹃、HNSC、GBM古沥、CESC和BRCA預后的危險因素瘸右，而在READ、THYM岩齿、OV太颤、MESO、LUSC和KIRC中盹沈，GPI錨定的生物合成是預后的保護因素龄章。KM生存曲線顯示，GPI錨定生物合成的增強與HNSC乞封，BRCA做裙，LGG和LUAD的不良預后有關(guān)（圖1C）。綜合Cox回歸肃晚、KM生存曲線和腫瘤和正常樣本中GPI-scores的表達結(jié)果锚贱，最終確定GPI錨定的生物合成可能在乳腺癌（BC）的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

GPI錨定生物合成的功能富集分析

根據(jù) GPI 評分的最佳臨界值关串，將 TCGA BC 患者分為 GPI 錨定生物合成高和低兩個隊列惋鸥。熱圖說明了不同患者亞組內(nèi)的不同基因表達情況（圖2A）。KEGG功能富集分析顯示悍缠，GPI錨定生物合成高的患者預后較差卦绣，伴有較低的免疫應(yīng)答，具體表現(xiàn)包括細胞因子-細胞因子受體相互作用下調(diào)飞蚓、輔助性T淋巴細胞（Th17滤港、Th1和Th2）細胞分化、原發(fā)性免疫缺陷、抗原處理和表現(xiàn)（圖2B)溅漾。有趣的是山叮，高GPI錨定生物合成組的患者表現(xiàn)出增強的代謝途徑，其特征是雌激素信號通路和AMPK信號通路添履，以及增強的脂肪酸代謝和皮質(zhì)醇合成分泌（圖2B）屁倔。此外，GSEA分析顯示暮胧，隨著GPI-score的升高锐借，蛋白質(zhì)分泌和雌激素反應(yīng)升高，過氧化物酶體代謝和氧化磷酸化途徑增強往衷。然而钞翔，IL2-STAT5信號轉(zhuǎn)導，IL6-JAK-STAT3信號轉(zhuǎn)導席舍，TNFA信號轉(zhuǎn)導布轿，干擾素γ反應(yīng)和炎癥反應(yīng)下調(diào)（圖2C）。

GPI錨定生物合成與T細胞耗竭的相關(guān)性

免疫浸潤分析顯示来颤，GPI評分與T細胞CD8汰扭、T細胞CD4記憶激活、Treg福铅、B細胞記憶和T細胞濾泡螺旋呈負相關(guān)（P<0.001）萝毛，與M2巨噬細胞呈正相關(guān)（P<0.001）（圖3A）。如圖3B所示本讥，參與GPI錨定生物合成的大多數(shù)基因的表達與不同的免疫細胞群呈顯著負相關(guān)珊泳。然后，采用共識聚類分析拷沸，根據(jù)包括TNF色查、IL-2、IFN-γ和CTL的特定TEX通路對BC患者進行分類撞芍。熱圖顯示了TEX在四組患者中其他分子通路的變化（圖3C）秧了。一致地，這些表征的 TEX 通路（包括 CYT 和 CD4 T 細胞以及 CD 8 T 細胞）在 C1-C4 中呈下降趨勢（圖 3D-F）序无，表明該研究中確定的四個 TEX 亞組準確代表了 TEX 分級階段的生物學验毡。此外，GPI錨定生物合成的強度隨著TEX的嚴重程度而增加（圖3G）帝嗡。

腫瘤微環(huán)境中GPI錨定生物合成的單細胞分析

作者使用GSE114727中的單細胞數(shù)據(jù)進行分析晶通，將樣本的的臨床信息投射到各種細胞亞群上以追蹤細胞起源，發(fā)現(xiàn)耗盡的CD8 T細胞主要存在于腫瘤組織中（圖4B）哟玷。與正常乳腺微環(huán)境相比狮辽，TME中各類型細胞的比例發(fā)生了顯著變化，其中B細胞、內(nèi)皮細胞喉脖、巨噬細胞和單核細胞的比例升高椰苟，而CD4 T細胞和CD8 T細胞的比例降低，取而代之的是耗竭的CD8 T細胞的大幅增加（圖4C)树叽。接著舆蝴，作者使用 InferCNV 算法在腫瘤上皮細胞群中定義了 127 個惡性細胞（圖 4D、E）并比較了惡性上皮細胞與正常乳腺上皮細胞GPI錨定生物合成的差異题诵，結(jié)果顯示洁仗，在惡性上皮細胞中，GPI錨定的生物合成反而減少了（圖4F）仇轻。在比較了其他腫瘤來源的細胞群中GPI錨定生物合成的改變情況后京痢，作者發(fā)現(xiàn)只有在CD8 T細胞和耗盡的CD8 T細胞之間才能觀察到顯著的差異（圖4G）奶甘。與正常的 CD8 T 細胞相比篷店，耗盡的 CD8 T 細胞中 GPI 錨定的生物合成要強得多。同樣臭家，KEGG生物通路的GSVA分析顯示疲陕，惡性和非惡性上皮細胞之間的GPI錨定生物合成沒有差異（圖4H），而這種差異在CD8 T細胞和耗竭的CD8 T細胞中很明顯（圖4I）钉赁。

TME中GPI錨定生物合成相關(guān)基因的偽時序分析

另外蹄殃，作者構(gòu)建CD8 T細胞和上皮細胞的分化軌跡，用于觀察腫瘤發(fā)生過程中CD8 T細胞耗竭和GPI錨定生物合成的代謝重塑過程你踩。在偽定時分析中诅岩，CD8 T細胞最初沿著軌跡路徑定位，并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谋M的CD8 T細胞（圖5A带膜，B）吩谦。基因熱圖表明PIGP膝藕、PIGC式廷、PIGU、PIGW芭挽、PIGV滑废、和GPAA1在軌跡路徑末端高度表達（圖5C），這意味著這些基因在耗盡的CD8 T細胞中高度表達袜爪。二維圖譜顯示了CD8 T細胞（綠色）和耗竭的CD8 T細胞（藍色）中基因的動態(tài)表達（圖5D）蠕趁。圖5G則表明，耗盡的CD8 T細胞中GPI錨定的生物合成的總體水平總是高于未耗盡的CD8 T細胞中的整體水平辛馆，并且隨著CD8 T細胞變得更加耗盡俺陋，代謝強度增加。

基于機器學習構(gòu)建T細胞耗竭診斷模型

將Metabric和TCGA BC隊列的GPI評分和TEX評分進行了相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)（r值）分別為-0.49和-0.51（圖6A倔韭，B）术浪。然后，利用XGBoost算法中的model_profile函數(shù)對Metabric BC隊列進行變分分析寿酌，評估GPI錨定生物合成相關(guān)基因的表達與BC患者T細胞耗竭狀態(tài)之間的相關(guān)性胰苏。部分依賴性曲線展示了單個基因表達對XGboost模型預測能力的影響（圖6C）。圖 6D 說明了每個 GPI 錨定的生物合成相關(guān)基因?qū)?Metabric BC 患者 T 細胞耗竭狀態(tài)的影響程度醇疼，可以觀察到 PIGQ 對患者的嚴重 T 細胞耗竭狀態(tài)影響最明顯硕并，其次是 GPAA1。最后秧荆，采用XGBoost和Logistic回歸方法構(gòu)建了2個BC隊列中GPI錨定生物合成相關(guān)基因相關(guān)的T細胞耗竭診斷模型倔毙。與 XGBoost 算法相比，Logistic 回歸模型在 Metabric 和 TCGA 隊列中都具有更高的 AUC 值乙濒，分別為 0.688 和 0.684（圖 6G陕赃，H），而 XGBoost 模型的 AUC 值為 0.637 和 0.623（圖 6E颁股、F）么库。

建立與GPI錨定生物合成相關(guān)的預后特征

為了驗證GPI錨定生物合成相關(guān)基因在BC中的預后價值，本文基于21個GPI錨定生物合成相關(guān)基因和T細胞耗竭的特征因素（TNF甘有、IL-2诉儒、IFN-γ）建立了基因特征（GPIS）】飨疲患者數(shù)量眾多的 Metabric 數(shù)據(jù)集用作訓練集忱反，而樣本數(shù)量較少的 TCGA 隊列用作驗證集。作者采用十倍交叉驗證框架來訓練和驗證 101 個預測模型滤愕，隨后確定每個集合的 C 指數(shù)温算，其中，最優(yōu)模型是隨機森林（RSF）该互，平均C指數(shù)最高（0.767）米者，如圖7A所示。然后宇智，利用RandomForestSRC算法對RSF的結(jié)果進行優(yōu)化蔓搞。圖7B代表了GPIS中表征基因的權(quán)重比，表明PIGV随橘、PIGU喂分、GPAA1和PGAP1是模型的核心基因。通過在 RandomForestSRC 中對 13 個基因表達值及其回歸系數(shù)進行加權(quán)机蔗，獲得了每位患者的風險評分（圖 7C）蒲祈。根據(jù)“surviminer”軟件包確定的風險評分最佳閾值甘萧，將患者分為高風險組和低風險組。KM曲線表明梆掸，與低風險隊列中的個體相比扬卷，被歸類為高風險的患者表現(xiàn)出顯著減少的OS持續(xù)時間（圖7D，E）酸钦。ROC分析測量了GPIS的區(qū)分度怪得，訓練數(shù)據(jù)集的3年、4年和5年AUC分別為0.62卑硫、0.64和0.65（圖7F）徒恋。驗證數(shù)據(jù)集中的 1 年、3 年和 5 年 AUC 分別為 0.68欢伏、0.60 和 0.59（圖 7G）入挣。

建立與GPI錨定生物合成相關(guān)的預后特征

在T細胞耗竭診斷模型和預后模型的特征權(quán)重分析中，作者選擇對GPAA1和PIGU進行進一步的全面研究硝拧。作者通過免疫浸潤分析了兩個基因與其他38種癌癥免疫細胞之間的相關(guān)性（圖 8A）径筏。CD8+T細胞在乳腺癌中的浸潤與GPAA1和PIGU的表達水平呈負相關(guān)。此外河爹，KM曲線表明GPAA1和PIGU高表達的患者具有較差的OS（圖8B匠璧，C）桐款。與正常乳腺細胞（MCF10A）相比咸这，GPAA1和PIGU在MCF7，MDA-MB-231和BT-474細胞中的表達相對較高（圖8D）魔眨。功能實驗表明敲低PIGU 能有效延緩 MCF7 和 MDA-MB-231 的細胞增殖（圖 8E）媳维。多重免疫熒光染色技術(shù)檢測了 GPAA1 和 PIGU 分子的表達水平，以局部乳腺癌組織中 CD8 T 細胞浸潤的程度遏暴，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞中GPAA1和PIGU的表達與鄰近淋巴細胞中CD8分子的表達呈負相關(guān)侄刽。當腫瘤細胞高表達GPAA1和PIGU時，外周浸潤淋巴細胞中CD8分子的熒光強度明顯降低朋凉，表明CD8+ T細胞數(shù)量減少（圖8F州丹，G）。

研究總結(jié)：

總的來說杂彭，作者目標很明確墓毒，確定一個明確與膜蛋白定位有關(guān)的基因集，選定特定癌癥乳腺癌亲怠，探討該基因集在乳腺癌中與免疫應(yīng)答中T細胞免疫浸潤的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)GPI錨定生物合成是乳腺癌的危險預后因素所计，通過免疫浸潤分析，發(fā)現(xiàn)該基因集與T細胞耗竭有關(guān)团秽，利用單細胞數(shù)據(jù)進一步分析基因集與特定細胞群的關(guān)系主胧，發(fā)現(xiàn)了GPI評分與耗竭CD8 T細胞顯著相關(guān)叭首，結(jié)合機器學習算法中的XGBoost算法構(gòu)建了以GPI錨定生物合成基因為基礎(chǔ)的預測T細胞耗竭模型，發(fā)現(xiàn)該模型在預測BC患者是否已經(jīng)發(fā)展為嚴重的T細胞耗竭具有高的AUC值踪栋，隨后作者結(jié)合基因與T細胞耗竭的特征因素焙格，進一步構(gòu)建了GPIS相關(guān)的預后風險評分模型。最后夷都，作者對組成模型的核心基因進行了功能上的驗證间螟，發(fā)現(xiàn)GPAA1和PIGU與BC預后不良和CD8 T細胞浸潤有關(guān)。