1. 背景
介紹
CRISPR的全稱Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats荔烧，意為成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列荒叼，Cas則是CRISPR-associated (Cas) systems浩淘。
CRISPR/Cas 系統(tǒng)是原核生物的免疫系統(tǒng)冤留，這個(gè)系統(tǒng)可以識(shí)別出外源 DNA譬巫，并將它們切斷捣鲸，沉默外源基因的表達(dá)漫贞，用來抵抗外源遺傳物質(zhì)比如噬菌體病毒和外源質(zhì)粒的入侵甸箱。這與真核生物中RNA干擾（RNAi）的原理是相似的。正是由于這種精確的靶向功能迅脐，CRISPR/Cas 系統(tǒng)被開發(fā)成一種高效的基因編輯工具芍殖。在自然界中，CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有多種類別谴蔑，其中 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是研究最深入豌骏，應(yīng)用最成熟的一種類別龟梦。
CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 來識(shí)別并剪切 DNA 以降解外來核酸分子。現(xiàn)在使用的 CRISPR/cas 9 系統(tǒng)是由最簡單的 type II CRISPR 改造而來窃躲，該系統(tǒng)由單鏈的 guide RNA 和有核酸內(nèi)切酶活性的 Cas 9 蛋白構(gòu)成计贰。
作用機(jī)理
??nature video視頻：CRISPR: 基因編輯原理及應(yīng)用
人類基因組有兩種方法進(jìn)行斷裂修復(fù)：NHEJ (不需要模板，隨機(jī)修復(fù)蒂窒，出錯(cuò)率高躁倒，引起基因knock out) 和HDR (需要模板，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)修復(fù)及knock in)洒琢。
Extended CRISPR techniques in recent years
技術(shù)路線
基因敲除：sgRNA+Cas9
基因敲入：sgRNA+Cas9+目的基因（HDR模版）
2. sgRNA的設(shè)計(jì)和制備
5‘端開始數(shù)20個(gè)堿基這一段是需要設(shè)計(jì)的秧秉，這一段用來識(shí)別目的基因上的靶標(biāo)，并通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原理與靶點(diǎn)位置結(jié)合衰抑。
gRNA再往后數(shù)76個(gè)堿基象迎，是另一段transactiviting RNA (tracrRNA)。它的序列是一定的呛踊，就像轉(zhuǎn)運(yùn)RNA一樣可以形成空間結(jié)構(gòu)砾淌，然后就可以和Cas9酶相結(jié)合。
這樣一條完整的gRNA就可以識(shí)別靶點(diǎn)恋技，并且把與它自身結(jié)合的Cas9酶帶到這個(gè)靶點(diǎn)拇舀，引導(dǎo)Cas9酶在靶點(diǎn)處對(duì)目的基因的雙鏈DNA進(jìn)行切斷逻族，從而達(dá)到基因編輯的目的蜻底。
目前又很多在線工具可以用于設(shè)計(jì)sgRNA
3. 靶標(biāo)細(xì)胞導(dǎo)入
不同的導(dǎo)入方式基因標(biāo)記效率和脫靶效率不同
4. 基因編輯效率確認(rèn)
5. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design
CRISPR-DO網(wǎng)站：根據(jù)crispr motif sequence的結(jié)果，對(duì)給定基因的locus上查找哪段motif可能是最有效的
參考：
CRISPR實(shí)驗(yàn)究竟怎么做聘鳞？手把手教給你
CRISPR/Cas9 基因編輯全套操作和解決方案（TAKARA 講解）
