單細胞測序技術(shù)將徹底改變整個生物科學
Single-cell sequencing-based?technologies will revolutionize ?whole-organism science
全文鏈接： https://www.nature.com/articles/nrg3542
核心觀點
DNA測序技術(shù)的發(fā)展使得能夠分析單細胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組向瓷，并且很快將實現(xiàn)單細胞表觀基因組學和蛋白質(zhì)組學分析。
單細胞基因組分析可揭示單個細胞之間的基因組變異性，并用于以譜系樹的形式重建細胞祖先谁榜。
單細胞轉(zhuǎn)錄組分析可用于研究單個細胞的功能狀態(tài)并以無偏差的方式推斷和發(fā)現(xiàn)細胞類型浮入。
基于高通量測序整合單細胞分析，將能夠同時分析細胞的基因組，轉(zhuǎn)錄組學和表觀基因組潦嘶。這些數(shù)據(jù)將揭示細胞的類型及其祖細胞创南，并以它們的當前功能狀態(tài)伦忠，推斷它們的祖細胞的類型和功能狀態(tài)。
單細胞綜合分析稿辙，將揭示生物學和醫(yī)學的基本問題昆码，包括癌癥起源和發(fā)生，人類細胞類型的數(shù)量和關(guān)系邻储，以及再生組織中細胞更新的速率和結(jié)構(gòu)赋咽。
Methods for single-cell isolation-單個細胞的分選方法
生物體有成千上萬種細胞類型，有多種方法可以從生物體組織中分離出單個的細胞吨娜。（主要分為隨機和靶向分離兩種）
號外：分離細胞是單細胞研究中最困難的步驟之一脓匿。目前的單細胞分離策略主要分為三類：手動分離、熒光激活的細胞分選和微流體技術(shù)宦赠。在進行單細胞轉(zhuǎn)錄分析之前陪毡，我們需要確定自己拿到了正確的細胞米母。如果你想要的細胞已經(jīng)處于懸浮狀態(tài)（比如循環(huán)腫瘤細胞），而且含量相對比較豐富毡琉，那么流式細胞分析將是你的理想選擇铁瞒。如果樣本是實體組織，我們可以用酶分解掉膠原和其他細胞外蛋白绊起。不過酶學消化對細胞影響較大精拟，甚至可能改變基因轉(zhuǎn)錄情況。把組織細胞制成懸液之后虱歪，我們就可以通過特異性的熒光標簽分離出自己想要的細胞蜂绎。進一步拿到單細胞是比較棘手的一步，可能需要用到微流體設(shè)備笋鄙。將細胞分散到懸液中师枣，會失去它們在組織里的位置信息。如果你想要了解單細胞所處的環(huán)境萧落，就得使用激光捕獲顯微切割技術(shù)践美。這種技術(shù)通過掃描組織切片定位目的細胞，并將其提取出來找岖。操作者需要非常小心陨倡，以免切到細胞或細胞核。數(shù)量最為稀少的細胞只能用毛細管等器具手動獲取许布。
從實體組織中分離單個細胞關(guān)鍵兩步：
第一步兴革，（單個細胞）通常是用酶解的方式把離體或者活體分解成單個的細胞；
第二步蜜唾，單個的細胞必須在單個的反應器中進行裂解和進一步的分析杂曲。
四種方式獲得單個細胞及其優(yōu)缺點（Table 1）： ?
顯微操縱（精密控制）（micromanipulation）
熒光激活的流式分選：flow sorting?using fluorescence-activated cell sorting (FACS)
激光捕獲顯微切割（Laser Capture Microdissection，LCM）
http://www.tj3zx.cn/system/2016/06/27/012259863.shtml
微流體技術(shù)（microfluidic?device）
Single-cell genomics
Reconstructing cell lineage trees using somatic mutations.?
基于體細胞突變重建細胞譜系圖袁余。
最初擎勘，人們認為同一個個體不同的細胞具有完全相同的基因組的觀點證明是錯誤的。體細胞分裂時DNA的復制不可能絕對精確無誤-引起體細胞突變颖榜。體細胞突變從受精卵階段開始積累棚饵，這些突變具有很高的幾率賦予我們身體中的每個細胞具有獨特的基因組特征。體細胞獨特的基因組信號可以構(gòu)建精度很高的細胞譜系朱转。人類生物學和醫(yī)學中尚未解決的核心問題實際上是關(guān)于人類細胞譜系樹的問題：它在發(fā)育蟹地，生長，更新藤为，衰老和疾病中的結(jié)構(gòu)怪与，動力學和變異性。完全了解每個細胞中積累的獨特體細胞突變將允許我們以極高的精度重建細胞譜系樹缅疟。
Cell lineage reconstruction of cancer will elucidate its development.?
癌細胞譜系重建將闡明其發(fā)展過程
細胞譜系重建癌癥將闡明其發(fā)展分别。癌癥患者通常不會死于腫瘤的發(fā)生遍愿，而是死于癌癥轉(zhuǎn)移。然而耘斩，盡管進行了數(shù)十年的研究沼填，關(guān)于轉(zhuǎn)移灶起源于何處的關(guān)鍵問題尚未得到徹底的闡述（圖2）。轉(zhuǎn)移癌細胞的來源癌癥病灶中的任何一個細胞還是來自于不腫瘤亞克吕ㄊ凇坞笙？或是來自于腫瘤干細胞？或者是轉(zhuǎn)移來自腫瘤細胞和正常移動的巨噬細胞融合形成的雜合體荚虚？化療后癌癥復發(fā)的原因薛夜，可能是普通腫瘤細胞隨機逃避化療引起的？癌細胞譜系對解答這些問題至關(guān)重要版述。
早期的實驗分析了每個細胞中的幾個關(guān)鍵標記梯澜。在最近的一個例子中，通過熒光原位雜交（FISH）測定單個細胞中多達8個染色體畸變及其組合的發(fā)生率渴析，來研究了急性淋巴母細胞白血病的異質(zhì)性和腫瘤起源晚伙。這使得在癌癥進展過程中可以分析亞克隆結(jié)構(gòu)。最近俭茧，使用數(shù)百個單核的測序產(chǎn)生個體乳腺癌細胞的近似拷貝數(shù)分布咆疗，從而重建腫瘤群體結(jié)構(gòu)和進化歷史。在另一項研究中母债，對患有骨髓增生性腫瘤的患者的全外顯子組進行單細胞測序民傻，以重建腫瘤祖細胞并識別出候選驅(qū)動突變。
使用二代測序構(gòu)建的體細胞突變譜系示蹤场斑，已經(jīng)在體內(nèi)大量細胞群體中得到了證實，但對于單個細胞尚無報道牵署。且bulk測序不能顯示漏隐，關(guān)于突變或畸變的不同組合的準確信息，解決此類問題有待構(gòu)建癌細胞的單細胞譜系分析
通向單細胞基因組學的道路奴迅。
雖然青责，現(xiàn)在對細胞群體的DNA進行測序已經(jīng)變得很容易，但對來自單細胞的DNA進行測序仍然是一個挑戰(zhàn)取具。盡管最近通量有所提高脖隶，獲得足夠深度的多個單細胞測序分析的成本仍然很高，這已經(jīng)成為限制大規(guī)模應用單細胞基因組學暇检，轉(zhuǎn)錄組學和表觀基因組學的阻力产阱。
Single-cell transcriptomics
單細胞轉(zhuǎn)錄組學
The molecular state of cell populations
細胞群的分子狀態(tài)
給定異質(zhì)細胞群，測量關(guān)鍵因子的平均值块仆，例如基因型构蹬，RNA輸出或目標基因座的表觀遺傳狀態(tài)王暗，僅提供系統(tǒng)狀態(tài)的部分表征。不幸的是庄敛，用于量化細胞群的分子狀態(tài)的大多數(shù)方法俗壹，從轉(zhuǎn)錄分析到蛋白質(zhì)組學，是基于通過平均單個細胞的信號來估計數(shù)百萬個細胞的集合中的平均行為藻烤。例如绷雏，不可能基于微陣列或RNA測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)確定基因表達的細胞間差異，或確定信號蛋白的中間水平是否是雙峰或均勻種群內(nèi)的結(jié)果怖亭∠严裕基于標準蛋白質(zhì)組學的分布。超越基于平均值的細胞群表征需要在不同尺度上平衡采樣細胞的數(shù)量和功能覆蓋的完整性（表2）依许。
Applications of single-cell transcriptomics.
單細胞轉(zhuǎn)錄組的應用
單細胞轉(zhuǎn)錄組學的應用棺禾。單細胞轉(zhuǎn)錄組學的一個主要應用是分析稀有細胞類型。例如峭跳，可以從患者血液中獲得循環(huán)腫瘤細胞膘婶，但是通常每個血液樣品僅分離少量細胞，并且這些細胞通常會被更多數(shù)量的正常細胞污染蛀醉。單細胞RNA-seq可用于區(qū)分這些細胞類型悬襟，同時從腫瘤中獲得表達數(shù)據(jù)。類似地拯刁，根據(jù)定義脊岳，早期人類胚胎僅包含稀有細胞類型，其僅存在于瞬時垛玻。關(guān)于早期發(fā)展的關(guān)鍵問題可以使用轉(zhuǎn)錄組學來解決割捅。在這種情況下，轉(zhuǎn)錄組學具有能夠使用序列多態(tài)性（例如帚桩，SNP）來區(qū)分衍生自兩個親本基因組中的每一個的轉(zhuǎn)錄物的優(yōu)點亿驾。另一個將從單細胞轉(zhuǎn)錄組學中獲益的領(lǐng)域是成體干細胞的研究，這種干細胞通常很少見账嚎，有時只是短暫存在莫瞬，并且可以與其他細胞類型混合。然而郭蕉，通過使用單細胞RNA-seq疼邀，可以簡單地通過從組織中取無偏倚的細胞樣品來廣泛地采樣每種細胞類型。單個細胞的大小召锈，形態(tài)旁振，發(fā)育起源和功能特性差別很大。然而，盡管在某些特定情況下取得了進展规求，但我們目前對細胞類型筐付，其起源，進化和多樣性的理解程度阻肿。
The road to single-cell transcriptomics.
單細胞轉(zhuǎn)錄組學之路
通往單細胞轉(zhuǎn)錄組學的道路瓦戚。盡管單分子DNA72,73,74和RNA92測序取得了進展，但尚不可能直接從單細胞中測序RNA丛塌。目前较解，RNA需要轉(zhuǎn)化為cDNA并進行擴增，這必須以最小的損失實現(xiàn)赴邻，并且不會引入太多的定量偏差印衔。
在單細胞轉(zhuǎn)錄組實驗中存在幾種噪聲源。全局（即姥敛，影響細胞中RNA的總量）和局部（例如由于共調(diào)節(jié)或大規(guī)模染色質(zhì)修飾）存在生物學波動奸焙。還存在技術(shù)噪音，例如由于移液誤差彤敛，溫度差異与帆，測序深度的差異，PCR擴增偏差和逆轉(zhuǎn)錄效率的差異墨榄。重要的是要認識到單細胞轉(zhuǎn)錄組分析也是單分子分析玄糟，因為許多基因僅在每個細胞的少數(shù)mRNA分子中表達。
Single-cell epigenomics and proteomics
單細胞表觀組和蛋白組
顯然袄秩，細胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組僅捕獲其部分狀態(tài)阵翎，并且細胞的大部分功能由其表觀基因組和蛋白質(zhì)組決定，這增加了群體中細胞的多樣性之剧。單細胞轉(zhuǎn)錄組學的另一個應用領(lǐng)域是轉(zhuǎn)錄波動的表征郭卫。 RNA含量的動態(tài)變化與循環(huán)過程相關(guān)，例如細胞分裂和晝夜節(jié)律的細胞周期背稼。其他波動是隨機的箱沦，反映了轉(zhuǎn)錄是由許多概率步驟組成的離散過程的事實。通過細胞分裂時細胞內(nèi)容的不均勻分配引入了進一步的異質(zhì)性雇庙。大量單細胞的直接轉(zhuǎn)錄組分析應該開啟對未受干擾的細胞群中振蕩和隨機調(diào)節(jié)過程的研究。在假定相同的細胞群中灶伊，可以鑒定多組共同調(diào)節(jié)的基因疆前。每組必須是功能過程的一部分，例如振蕩器或隨機過程聘萨。
conclusion
結(jié)論
單細胞是生命的基本單位竹椒。因此，單細胞分析不僅僅是更進一步地邁向更敏感檢測米辐，而且是對生物學更基本原理理解質(zhì)的飛躍胸完。在這里书释，我們描述了基于單細胞測序分析的最新進展。這些進展包括單個細胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組測序赊窥，我們預測很快就可以在數(shù)千甚至數(shù)百萬個細胞中的核酸完成全基因組測序爆惧。此外，我們也描述了如何將細胞現(xiàn)象轉(zhuǎn)換為基于DNA序列的讀數(shù)锨能。例如扯再，可以通過ChIP-seq將諸如組蛋白修飾的表觀基因組標記轉(zhuǎn)化為DNA信號。類似地址遇，蛋白質(zhì)修飾和相互作用可通過鄰近連接測定法轉(zhuǎn)化為DNA信號熄阻。
DNA測序的海量信息及其不斷增長的勢頭，意味著許多不同的細胞現(xiàn)象可轉(zhuǎn)化為DNA讀出倔约。這種融合的結(jié)果應該允許多種模態(tài)的綜合測量秃殉。這種整合的可行性已經(jīng)在基因組學和轉(zhuǎn)錄組學分析中得到證實，并且同時分析單細胞中的DNA浸剩，RNA和蛋白質(zhì)可用于定量描述分子生物學的中心法則钾军。盡管單細胞分析方法正在快速發(fā)展，但在單細胞整合分析中同時分析多種特性仍待開發(fā)乒省。細胞特性之間的生化差異導致分析它們的方法需要改變巧颈。并有待開發(fā)通用性的單細胞多特性分析測量。這種整合單細胞遺傳，表觀遺傳散吵，轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組學的分析方法（圖1）榕暇，將允許構(gòu)建多個分子標記之間的關(guān)系，無偏見的識別復雜細胞群結(jié)構(gòu)唇礁，直接或間接表征其之間的因果關(guān)系。開發(fā)復雜的單細胞遺傳分析方法可以更好地理解這些細胞特性惨篱，并重新定義“細胞類型”的概念盏筐。這種整合的可行性已經(jīng)在基因組學和轉(zhuǎn)錄組學分析中得到證實。
最后砸讳，在發(fā)育過程中單個細胞的突變的積累琢融，可以用于推斷每個細胞的祖細胞。雖然細胞命運圖描述了特定狀態(tài)下細胞的下一潛在狀態(tài)簿寂，但并不能獲得它們的精確譜系關(guān)系漾抬。相比之下，使用體細胞突變重建細胞譜系樹常遂，不但能獲得細胞間的譜系關(guān)系纳令，還可以提供它們祖細胞的狀態(tài)信息。我們預計，對單細胞進行的綜合分析將為推動小鼠和人類等高等生物研究發(fā)展提供動力平绩。如果采樣細胞的狀態(tài) - 由它們的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組決定圈匆，并且可由它們的蛋白質(zhì)組進一步增強 - 構(gòu)成重建細胞譜系樹的葉子，那么可以精確的知道捏雌，其祖細胞的狀態(tài)跃赚；由譜系樹內(nèi)部節(jié)點可以形式化為數(shù)學模型。這將允許擴展重建范圍來描述其狀態(tài)改變的動態(tài)腹忽，并將細胞譜系樹與細胞命運整合在一起来累。
高等生物的細胞譜系樹可以回答人類生物學與醫(yī)學中的許多開放性問題，并且有可能將醫(yī)學轉(zhuǎn)變?yōu)閭€性化的診斷和治療窘奏。大約十年前嘹锁，就有人提出，單細胞基因組學的發(fā)展可能會開啟“人類細胞譜系項目”着裹，并以重建整個人類細胞譜系樹為目的领猾。我們相信，對單細胞測序技術(shù)的回顧和發(fā)展將是我們更接近使實現(xiàn)這一目標骇扇，并將徹底改變整個有機體科學摔竿。
