-前記
想學(xué)新東西饵较，就要大量總結(jié)相似問(wèn)題树叽。因此靴跛，應(yīng)該對(duì)所有做的實(shí)驗(yàn)先做一遍總結(jié)。2020.12.3記
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h1>
獲得目的基因的PCR產(chǎn)物羞延，用于后續(xù)的連接反應(yīng)
實(shí)驗(yàn)要求
提前準(zhǔn)備：稱(chēng)量空的離心管渣淳；干凈的濾紙，干凈的刀片伴箩，干凈的2.0mlEP管2個(gè)入愧，1.5mlEP管1個(gè)，廢舊柱子1個(gè)配平用嗤谚，普通水一管配平用棺蛛；打開(kāi)金屬浴，設(shè)置好56-60℃巩步，放上無(wú)菌dd水旁赊，start；槍?zhuān)瑯岊^椅野，桌面垃圾桶终畅，計(jì)時(shí)器籍胯，剪刀。
膠回收應(yīng)該換全新的電泳液去做凝膠電泳离福；小槽子要用80V的電壓去跑杖狼；制膠要在0.7%的濃度；要視自己樣的體積來(lái)選取梳子术徊，因?yàn)樾】滓M量加樣加滿(mǎn)本刽，充分利用膠。
切膠盡量切小赠涮，但不能切掉條帶子寓，提高回收效率，就切四刀笋除，干凈利落斜友；切膠后要用干凈濾紙吸去水分；可用槍頭搗碎膠塊垃它，加速溶解鲜屏。-已加入練習(xí)清單
金屬浴要提前打開(kāi)，提前放入dd水国拇；加入好溶膠液后的離心管放入金屬浴后洛史，每2-3min輕輕旋轉(zhuǎn)/用手指輕彈，千萬(wàn)不要用漩渦震蕩儀去震蕩
在金屬浴加熱過(guò)后的溶膠液需要冷卻到室溫才可以加至吸附柱中
加入柱子的DD應(yīng)留一部分空余酱吝，不要溢出來(lái)也殖；若用于膠回收的液體過(guò)多，應(yīng)分批次加入同一個(gè)吸附柱離心务热，不能再啟用新吸附柱忆嗜。Q水下去后，柱子里面是真空的嗎崎岂？
漂洗液WB需要事先加入無(wú)水乙醇捆毫，特別注意要在無(wú)菌條件下用滅過(guò)菌的50ml的離心管去加，這樣做是引物要盡可能防止過(guò)程的污染
最后一步冲甘，要在把30微升的無(wú)菌水打到吸附膜的中央绩卤，千萬(wàn)不可偏離。-已加入練習(xí)清單
膠回收后的液體江醇，有兩種方法探究濃度省艳，一是去儀器那里測(cè)濃度，二是與maker跑膠嫁审，肉眼比對(duì)亮度來(lái)估計(jì)濃度跋炕，一定要記好加了多少的樣多少的maker。
關(guān)于去除乙醇時(shí)的空轉(zhuǎn)是否打開(kāi)蓋子律适？辐烂？遏插？不理解。為什么有些操作就要在通風(fēng)櫥里面通風(fēng)纠修。胳嘲？？扣草？
Check-list
?梳子TAE制膠跑膠
?六孔紅色梳子30ml TAE制小膠點(diǎn)50ul滿(mǎn)當(dāng)了了牛，將溢出
?三孔等距白色梳子30ml TAE制小膠跑50ul以上
膠回收后要跑膠驗(yàn)證，一來(lái)肉眼觀看濃度辰妙，二來(lái)查看是否有隱形帶未分開(kāi)的帶鹰祸。
單獨(dú)一個(gè)gene+切比較好
用水洗脫，DNA片段應(yīng)該保存在一20℃密浑。
[實(shí)驗(yàn)解析]
(1) 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意:
①為了保證回收效果蛙婴，電泳時(shí)使用新鮮電泳緩沖液。
②切膠時(shí)膠塊盡量小尔破，溶膠時(shí)確保膠塊完全溶化街图。
③為避免紫外照射造成DNA損傷，影響下游連接反應(yīng)懒构，在切膠時(shí)盡量縮短紫外照射時(shí)間餐济。
(2)多數(shù)回收試劑盒對(duì)于過(guò)小或過(guò)大的DNA片段的回收效率較低。因此胆剧，在回收過(guò)小或過(guò)大的 DNA時(shí)（尤其是目的基因片段過(guò)小)絮姆，需要注意查看說(shuō)明書(shū)中的 DNA片段大小范圍。
(3）有些酶切產(chǎn)物酶切后仍為單一的 DNA片段赞赖，不需要進(jìn)行跑膠回收，如目的基因PCR產(chǎn)物酶切后冤灾，往往只切除掉了幾個(gè)保護(hù)堿基前域。這種情況下，直接向酶切產(chǎn)物中加入3倍體積的溶膠液GSB韵吨，按照后續(xù)步驟回收即可匿垄。若酶切體系小于100ul，建議先用ddH,O將體系補(bǔ)足至100ul归粉。
操作提綱
1.提前準(zhǔn)備
查看是否有人在用電泳儀椿疗，TAE是否夠，打開(kāi)金屬浴設(shè)定60℃糠悼，將EB/水預(yù)熱
拿大盤(pán)子準(zhǔn)備：計(jì)時(shí)器届榄、槍?zhuān)?000 & 100）、槍頭（大 & 中）倔喂、離心管（2ml&1.5ml提幾個(gè)拿幾套）練習(xí)用的離心管铝条、濾紙靖苇、馬克筆、配平用的小燒杯水班缰、瓊脂糖凝膠純化試劑盒
2.簡(jiǎn)要步驟（艾德萊生物）
簡(jiǎn)略版
天平放空的2ml EP管贤壁，去皮
.紫外燈下切膠，放濾紙吸水2秒立馬放入空2ml EP管埠忘，稱(chēng)量脾拆，稱(chēng)量*3即為要加入的DD體積（ml）
金屬浴 56℃ 10min，每2-3分鐘手指輕彈一次幫助加速莹妒。別轉(zhuǎn)名船，到處都是。
趁這時(shí)間做平衡液預(yù)處理：+100ul平衡液到柱子 13000r 1min 棄廢液
DD冷卻至室溫加入柱子动羽，放1min（趁這時(shí)間搞配平）包帚，12000r 30-60s 棄廢液。如果總體積超過(guò)750ul运吓，分兩次同一柱子離心
+600ul WB, 12000r 30s 棄廢液
重復(fù)+600ul WB, 12000r 30s 棄廢液
空轉(zhuǎn) 12000r 2min
拿柱子放進(jìn)干凈1.5ml EP 管渴邦，拿100槍和槍頭去金屬浴跟前，+dd水 30ul or +EB 30ul拘哨，放置5min谋梭，12000r 1min
標(biāo)記好 膠回收 名字 幾月幾號(hào) 濃度
用水洗脫，DNA片段應(yīng)該保存在一20℃
3.安全注意事項(xiàng)
EB致癌物
4.可能出現(xiàn)的現(xiàn)象
我遇到的問(wèn)題
用WB洗一次不行倦青，阿鮑跑出來(lái)是彎的瓮床。？产镐？隘庄？
可能遇到的問(wèn)題的解決方案
5.方法/心得/技巧
1.??提高膠回收量的辦法：
1)??增加電泳時(shí)的上樣量。
2)??電泳緩沖液用新鮮配制的癣亚。
3)??切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠丑掺，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率述雾。
4)??把切的兩塊或多塊膠融化后街州，無(wú)論多大的體積都用一個(gè)管子，轉(zhuǎn)移到同一個(gè)柱子上玻孟。
5)??溶膠時(shí)所加的溶液可多一點(diǎn)唆缴，這樣更有利于DNA與膜的結(jié)合，不過(guò)一般不要多余750ul黍翎。
6)??膠回收的關(guān)鍵是通過(guò)柱子的溶液的鹽濃度面徽、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結(jié)合，因此匣掸，若電泳緩沖液的PH偏高斗忌，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0质礼，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好的攔截在膜上织阳，可以添加30％異丙醇在加熱溶解膠后的液體里眶蕉。
7)??加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘）唧躲，以使乙醇充分揮發(fā)造挽。
8)??最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積弄痹，一般用30-50μl洗脫液洗脫（不能太少饭入，否則無(wú)法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央肛真，以充分洗脫結(jié)合在膜上的DNA谐丢。
9)??可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫蚓让，或用封口膜密封4度過(guò)夜乾忱，第二天再離心回收，效果不錯(cuò)历极。
10)??將離心后的洗脫液加回吸附柱窄瘟，再次離心。
2.??幾種PCR 產(chǎn)物回收的詳方法和步驟
1)??普通膠回收
如果要膠回收趟卸，最好還是用試劑盒蹄葱，方便，回收率也略高锄列，實(shí)在要手工回收图云，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后邻邮，酚竣况、酚／氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可饶囚。另外好像還有冷凍法帕翻，沒(méi)作過(guò)鸠补，不是很清楚萝风。
2)??從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA
純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA）紫岩，置65℃水浴5分鐘保溫规惰，使凝膠完全溶解。待放至室溫泉蝌，加等量酚（TE飽和歇万，TE封在上層揩晴，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻）贪磺，12000rpm硫兰，3分鐘離心。反復(fù)1-2次寒锚。取上層液劫映，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無(wú)水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀刹前。將純化的DNA加適量TE溶解泳赋，測(cè)定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析喇喉，探針制備等）祖今。
3)??擴(kuò)增特異性好的PCR回收
如果PCR擴(kuò)增特異性好，只是簡(jiǎn)單的PCR產(chǎn)物純化回收拣技，可以在PCR產(chǎn)物中加入50ug／ml 的蛋白酶K千诬，37度1h，酚／氯仿抽提一次过咬，氯仿抽提一次大渤，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無(wú)水乙醇沉淀回收掸绞。
3.??不需膠回收就可直接連接的方法
1)??低溫冷凍析出法
跑電泳時(shí)用低熔點(diǎn)的agarose膠泵三，跑到一定時(shí)候，將目的條帶所在的那一段膠切下衔掸，盡量切干凈烫幕，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且敞映，把底下沒(méi)有脫氧核酸的那點(diǎn)膠也盡量切掉较曼，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負(fù)75度冰箱中10－30分鐘振愿，接著1捷犹，300rpm離心5－10分鐘，取10ul上清冕末，加入連接體系中萍歉。將其余的液體也吸出，儲(chǔ)存在另一個(gè)管子中档桃，做好標(biāo)記枪孩，放在－20度備用。
2)??酶切后的直接連接
在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩選出連接好的片斷的
另外注意
1.瓊脂糖對(duì)回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多蔑舞，可以增加溶膠液拒担，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用柱子的話(huà)）攻询。對(duì)于小于１００ｂｐ的片段回收从撼，可加至30%異丙醇。
2.如果是用PAGE回收钧栖，用水或TE溶解谋逻，槍頭搗碎，過(guò)夜浸泡桐经，即可毁兆。當(dāng)然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標(biāo)記的探針用X片阴挣，未標(biāo)記的用EB气堕。
3.選用回收效率較高的柱子，比如進(jìn)口的Qiaquick spin column畔咧。
4.參照分子克隆用低熔點(diǎn)膠回收茎芭。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳誓沸，離心管低部加玻璃棉梅桩，高速離心等方法回收DNA片段。
4.DNA小片段的純化回收
小于100bp的片斷通常在電泳時(shí)就比較難觀察分辨拜隧，需要用分辨率很高的瓊脂糖或者丙烯酰胺凝膠宿百。比如Cambrex的NuSieve 3:1或者GTG，或者是大名鼎鼎的MetaPhor瓊脂糖洪添。所以實(shí)際上對(duì)于小片斷垦页，可以分為兩種情況：
一個(gè)是真的要回收電泳中特別小的片斷，這種情況我們前面有提到干奢，比如Qiagen MinElute系列可以回收70bp以上的片斷痊焊；而QIAEX純化介質(zhì)可以回收40bp以上的小片斷，可以根據(jù)情況選擇忿峻。
另外一種情況是要去除一些小片斷或者是核苷酸薄啥、標(biāo)記物、或者是一些酶切碎片逛尚，或者去掉接頭（Linker/Adeptor）或者什么的垄惧。其實(shí)這時(shí)已經(jīng)不需要用電泳來(lái)分別，也就算不上膠回收的范圍黑低，不過(guò)既然提到了就順手寫(xiě)寫(xiě)赘艳。
PCR產(chǎn)物回收試劑盒實(shí)際上也是一種除去小片斷的試劑盒，通晨宋眨回收范圍是100bp到10KB之間蕾管，也就是說(shuō)將小于100bp（或者70bp）的引物或者引物二聚體連同其他雜質(zhì)一同去除，操作簡(jiǎn)單菩暗，只需要將PCR產(chǎn)物加入過(guò)濾純化柱中離心掰曾，清洗一次，洗脫就可以了停团，5分鐘搞定旷坦，回收率高達(dá)95%。
PCR后需要酶切時(shí)佑稠，以前常常為省略跑膠純化的步驟秒梅，要在PCR產(chǎn)物中直接酶切，往往導(dǎo)致一些酶切問(wèn)題舌胶，如今用這種PCR產(chǎn)物純化試劑盒就不用電泳捆蜀，5分鐘OK了。用不著冒險(xiǎn)直接酶切――萬(wàn)一酶切有問(wèn)題多麻煩呀幔嫂。
通常同一個(gè)品牌的PCR產(chǎn)純化試劑盒和膠回收試劑盒的柱子是同樣的柱子辆它，區(qū)別是膠回收試劑盒多一個(gè)溶膠液。所以履恩，你可以用膠回收試劑盒做PCR產(chǎn)物純化锰茉，溶膠液照加可也，調(diào)pH和鹽濃度而已切心。
如果需要純化寡核苷酸或者引物飒筑，Qiagen的QIAquick Nucleotide Removal Kit是一個(gè)好選擇≌阑瑁可以用于純化17-40mer的寡核苷酸小分子扬霜，以及40bp-10kb的DNA 。用于純化標(biāo)記反應(yīng)是不錯(cuò)的選擇而涉，方法和PCR產(chǎn)物回收試劑盒是一樣的著瓶，很方便。
除了這種膜吸附的柱子啼县，還有一種凝膠過(guò)濾原理的柱子也可以用于分段收集不同大小的產(chǎn)物材原，那個(gè)在建庫(kù)等實(shí)驗(yàn)中用的比較多，也有用于純化標(biāo)記反應(yīng)中的未標(biāo)記分子或者核苷酸的季眷。
很小的DNA 片斷常常會(huì)用PAGE膠電泳余蟹。
PAGE膠好像還沒(méi)有很好的溶解方法，除了我們前面提到的電洗脫子刮，Qiagen還提供一些私人方法威酒，在應(yīng)急的時(shí)候可以嘗試窑睁。將切割下來(lái)的PAGE條帶沖洗后加入指管中，加入2倍體積的分散緩沖液（0.5M醋酸胺葵孤、10mM的醋酸鎂担钮，1mM?EDTA， 0.1%SDS尤仍，pH8.0）50度保溫30分鐘箫津，離心取上清，避免混入碎膠宰啦，加入3倍體積的溶膠液苏遥，后面步驟一樣。這樣也可以回收PAGE膠里的片斷赡模。
技術(shù)原理
詳細(xì)版
下面步驟來(lái)自實(shí)驗(yàn)室的北京艾萊德的瓊脂糖凝膠回收試劑盒田炭，不同試劑盒步驟不一樣。說(shuō)明書(shū)：http://www.aidlab.cn/up_product/big/2013-2-22-1449764178.pdf
關(guān)于平衡液
介紹:核酸吸附硅膠膜柱子長(zhǎng)期放置過(guò)程中會(huì)同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力漓柑。一般剛買(mǎi)來(lái)2,3個(gè)月的新硅膠柱子不需要使用平衡液诫肠。硅膠柱經(jīng)平衡液預(yù)處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團(tuán)，提高核酸的結(jié)合能力欺缘。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量栋豫。平衡液是強(qiáng)堿性溶液，若不小心碰到谚殊，請(qǐng)用大量自來(lái)水清洗丧鸯。100ul平衡液加入柱子中，13000r 1min 棄廢液嫩絮，即可預(yù)處理完畢丛肢。
提示:第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無(wú)水乙醇，加入后請(qǐng)及時(shí)打鉤標(biāo)記已加入乙醇剿干，以免多次加入!
1.在長(zhǎng)波紫外燈下蜂怎，用干凈刀片將所需回收的DNA條帶切下，盡量切除不含DNA的凝膠置尔，得到凝膠體積越小越好杠步。
注：切膠回收時(shí)，紫外燈觀察對(duì)DNA片段有損壞作用榜轿，應(yīng)該盡可能使用能量低的長(zhǎng)波紫外線(xiàn)幽歼，并且盡可能的縮短紫外線(xiàn)下處理的時(shí)間。
2.將切下的含有DNA條帶凝膠放入1.5ml離心管谬盐，稱(chēng)重甸私。
先稱(chēng)一個(gè)空1.5ml離心管重量，然后放入凝膠塊后再稱(chēng)一次飞傀，兩次重量相減皇型，得到凝膠的重量诬烹。
3.加3倍體積溶膠液DD。
如果凝膠重為100mg弃鸦，其體積可視為100ul绞吁，則加入300pul溶膠液。如果凝膠濃度大于2%寡键，應(yīng)加入6倍體積溶膠液。
4.56℃水浴放置10分鐘（或直至膠完全溶解)雪隧。每2-3分鐘渦旋震蕩一次幫助加速溶解西轩。
5.可選,一般不需要:每100mg最初的凝膠重量加入150ul的異丙醇，震蕩混勻脑沿。
有時(shí)候加入異丙醇可以提高回收率藕畔，加入后不要離心∽矗回收大于4Kb的片段時(shí)注服，不加入異丙醇，加入有時(shí)反而可能降低回收效率措近。
6.將上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)溶弟，室溫放置1分鐘，
12,000rpm離心30-60秒瞭郑，倒掉收集管中的廢液辜御。
如果總體積超過(guò)750ul，可分兩次將溶液加入同一個(gè)吸附柱EC中屈张。
7.加入700ul漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!)擒权，12,000rpm離心30
秒，棄掉廢液阁谆。
8.加入500ul漂洗液WB碳抄，12,000rpm離心30秒，棄掉廢液场绿。
9.將吸附柱EC放回空收集管中剖效，12,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液焰盗，以免漂
洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)贱鄙。
10.取出吸附柱EC，放入一個(gè)干凈的離心管中姨谷，在吸附膜的中間部位加50ul洗脫緩
沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中加熱效果更好)逗宁，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘梦湘。如果需要較多量DNA瞎颗，可將得到的溶液重新加入吸附柱中件甥，離心1分鐘。
洗脫體積越大哼拔，洗脫效率越高引有，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積倦逐，但是最小體積不應(yīng)少于25ul譬正，體積過(guò)小降低DNA洗脫效率，減少產(chǎn)量檬姥。
注：洗脫液EB不含有整合劑EDTA曾我，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)健民。也可以使用水洗脫抒巢，但應(yīng)該確保pH大于7.5，pH過(guò)低影響洗脫效率秉犹。用水洗脫蛉谜，DNA片段應(yīng)該保存在一20℃。DNA片段如果需要長(zhǎng)期保存崇堵，可以用TE緩沖液洗脫（ 10mMTris-HCl型诚，1mM EDTA，pH 8.0>鸳劳，但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)俺驶，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。
