一迂求、實(shí)驗(yàn)原理：
質(zhì)粒的抽提與純化實(shí)質(zhì)上是將質(zhì)粒DNA與細(xì)菌的基因組染色體DNA、RNA酱鸭、蛋白質(zhì)劫樟、細(xì)胞膜等細(xì) 胞器及其他大分子物質(zhì)分離的過(guò)程痪枫，因此質(zhì)粒的抽提大致可分為：細(xì)菌的培養(yǎng)、收集與裂解叠艳；質(zhì)粒DNA 的分離與純化奶陈；濃度、純度的鑒定三個(gè)過(guò)程附较。
①染色體DNA的去除：在富集培養(yǎng)目標(biāo)菌種后吃粒，首先應(yīng)裂解細(xì)菌細(xì)胞，采用含有SDS的NaOH溶液裂解菌體釋放質(zhì)粒拒课，同時(shí)氫氧化鈉的強(qiáng)堿性徐勃，可使DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞而變性早像，再加入中和緩沖液疏旨，可使部分變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA不復(fù)性扎酷，因此使質(zhì)粒DNA與染色體 DNA分離開(kāi)。
②細(xì)菌中的RNA可以通過(guò)RNaseA去除
③蛋白質(zhì)的去除：細(xì)菌中的蛋白質(zhì)可以通過(guò)酚/氯仿/異戊醇抽提遏匆，酚可以使蛋白質(zhì)變性法挨，氯仿將微溶 于水的酚抽提到有機(jī)相中，使其與水相中的DNA分離幅聘。分離后的質(zhì)粒DNA可以通過(guò)乙醇回收凡纳，乙醇可以消除核酸水化層，暴露其帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)帝蒿，因 此在陽(yáng)離子充足的環(huán)境中可以發(fā)生”核酸–乙醇沉淀
④蛋白質(zhì)荐糜、染色體DNA、細(xì)胞碎片葛超、以及在分離過(guò)程中與試劑形成的不溶復(fù)合物都可以通過(guò)離心去除暴氏。
⑤試劑盒法DNA的回收:除堿裂解法以外，還可以通過(guò)試劑盒抽提質(zhì)粒DNA绣张，在堿裂解進(jìn)行變性和復(fù)性后的純化回收通過(guò)純化柱進(jìn)行答渔。純化柱中的硅膠膜能在高鹽、低PH條件下吸附體系中的 DNA侥涵，將其與其他雜志分離沼撕，而在低鹽宋雏、高PH條件下DNA又可以被洗脫下來(lái)。
⑥純化后的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳或紫外分光光度計(jì)鑒定
電泳法：帶負(fù)電荷的DNA分子在外加電場(chǎng)的作用下向正極泳動(dòng)务豺，不同分子量大小與構(gòu)型的DNA分子泳動(dòng)速率不同磨总，因此可以在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)不同的條帶。在凝膠中加入核酸染料可以方便我們觀察笼沥，因?yàn)楹怂崛玖峡梢郧度氲紻NA堿基之間蚪燕，避免被凝膠中的氫離子淬滅，因而亮度更高敬拓。
紫外分光光度法：DNA的吸收峰在260nm處邻薯，蛋白的吸收峰在280nm處，因此可以用OD260/OD280判斷DNA純度乘凸，一般認(rèn)為比值在1.8~2.0之間時(shí)厕诡，純度較高
二、主要試劑及材料：
材料：
含有pSK II質(zhì)粒的大腸桿菌菌株的菌液营勤、含有MP3質(zhì)粒的大腸桿菌菌株的菌液
試劑：
①細(xì)菌的培養(yǎng)：LB培養(yǎng)基灵嫌、氨芐青霉素
②細(xì)菌的裂解與收集：溶液I（Tris-HCl、EDTA葛作、Glucose）寿羞、溶液II（NaOH、SDS）赂蠢、溶液 III（KOAc绪穆、CH3COOH）、RNAseA
③質(zhì)粒DNA的分離與純化：酚/氯仿/異戊醇虱岂、無(wú)水乙醇玖院、70%乙醇、1XTE溶液（Tris-HCl第岖、 EDTA）难菌、東盛生物小提質(zhì)粒盒
④電泳：瓊脂糖、0.5XTBE電泳緩沖液蔑滓、StarGreen DNA Dye郊酒、loading buffer、1XTE buffer
三键袱、實(shí)驗(yàn)步驟
①細(xì)菌的培養(yǎng)：
將含有pSK II和MP3質(zhì)粒的大腸桿菌菌液分別于LB培養(yǎng)基上劃線 → 37℃過(guò)夜培養(yǎng) → 挑取培養(yǎng)基上的單菌落于液體LB培養(yǎng)基中燎窘，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜
②細(xì)菌的收集與裂解
- 堿裂解法
吸取1.5ml菌液12000rpm離心1min (沉淀菌體)
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棄上清培養(yǎng)液 (完成細(xì)菌的收集)
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加入150ul溶液I和3ul RNaseA，震蕩混勻蹄咖，靜置2min (懸浮菌體荠耽、去除RNA)
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加入250ul溶液II，輕柔顛倒混勻比藻，放置至清亮(不超過(guò)5min铝量。裂解菌體倘屹、釋放質(zhì)粒，此步驟動(dòng)作輕柔慢叨，防止基因組DNA斷裂纽匙，且時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng))
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加入180ul溶液III，顛倒混勻拍谐，冰浴10min （中和反應(yīng)烛缔，防止基因組DNA污染）
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12000rpm離心5min，吸取上清80ul轩拨，重復(fù)此操作 (此時(shí)已完成了染色體DNA践瓷、RNA、細(xì)胞碎片亡蓉、部分 蛋白質(zhì)的分離)
③質(zhì)粒DNA的分離
加入53ul的酚/氯仿/異戊醇上下顛倒抽提10min晕翠，靜置分層 （DNA在水相中），12000rpm 離心10min
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通風(fēng)櫥中吸取上清砍濒，加入20體積的無(wú)水乙醇 （發(fā)生核酸-乙醇沉淀）
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12000rpm離心5min,倒掉乙醇淋肾，短暫離心10s，用移液槍吸取乙醇
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加入500ul 70％乙醇洗滌DNA沉淀爸邢，離心5min樊卓，倒掉乙醇，離心10s杠河，用移液槍吸取乙醇碌尔，將其放置在通風(fēng)櫥中促進(jìn)乙醇揮發(fā)
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加入300ul 1XTE溶解，65℃熱板溫育10min
④純化質(zhì)粒DNA
加入1XTE使溶液為300ul券敌，加入300ul酚/氯仿唾戚，充分震蕩抽提5min(去除蛋白)
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12000rpm離心5min，吸取上清
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加入1/10體積3M NaAc和2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇陪白，混勻
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置于-70℃冰箱15min沉淀DNA
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4℃12000rpm離心15min，倒掉乙醇膳灶，離心10s咱士，用移液槍吸去乙醇
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0.5ml 70%乙醇洗DNA沉淀一次，離心2min轧钓，倒掉乙醇 （去除DNA中的鹽離子）
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離心10s序厉，移液槍吸去乙醇，在50-60℃熱板上烘干1min
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加入20ul 1XTE溶解DNA沉淀毕箍，并在65℃熱板上溫育10min （使DNase失活）
-試劑盒抽提法
前面步驟與堿裂解法相似弛房，參考試劑盒說(shuō)明書，純化在純化柱上進(jìn)行
加入溶液III離心后的上清液置于DNA純化柱中而柑，靜置2min
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12000rpm離心1min文捶，棄濾液 （DNA被吸附到硅膠膜上）
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加入500ul溶液PB荷逞，12000rpm離心1min，棄濾液 （洗脫蛋白粹排、鹽等雜質(zhì)）
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加入500ul溶液W种远，12000rpm離心1min，棄濾液 （重復(fù)此步驟一次顽耳，洗掉多余鹽離子及乙醇）
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12000rpm離心3min （徹底去除純化柱中殘留的液體）
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將DNA純化柱置于新的離心管中坠敷，向純化柱中央處懸空滴加80ul溶液Eluent，室溫靜置2min （將硅膠吸附柱上的質(zhì)粒DNA洗脫下來(lái)）
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12000rpm離心1min （管底即為質(zhì)粒DNA）
⑤瓊脂糖凝膠電泳觀察
制膠：
稱取1.2g瓊脂糖加入盛100ml 0.5XTBE電泳緩沖液的250ml 三角瓶中射富，搖勻
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微波爐加熱至瓊脂糖溶解（沸騰）
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放在冷水中冷卻膝迎，加入10ul的StarGreen DNA Dye，搖勻
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瓊脂糖倒入模具中胰耗，插上梳子 限次。凝固后向上垂直拔出梳子，將凝膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中宪郊，加入0.5XTBE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1mm
點(diǎn)樣：
按照堿裂解法純化前的MP3掂恕、pSK II樣品各3ul、5ul Marker（10ug/ul弛槐、20ug/ul懊亡、60ug/ul）、堿裂解法純化后的MP3乎串、pSK II樣品各6ul店枣，試劑盒提取的MP3、pSK II樣品各2ul的順序依次加入點(diǎn)樣板小孔中叹誉，再分別加入10Xloading buffer鸯两，配置10ul點(diǎn)樣體系，吹吸混勻
電泳：
打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)长豁，調(diào)節(jié)電壓3-5V/cm
觀察：
將電泳好的凝膠置于凝膠成像儀中觀察
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