影響因子：11.1

研究概述：食管鱗狀細胞癌（ESCC）是一種致命的惡性腫瘤。免疫檢查點抑制劑（ICIs）為ESCC患者帶來了巨大的臨床益處火本。作者旨在通過整合多種程序性細胞死亡（PCD）形式危队，構建一個預測預后和對ICIs反應的模型。收集與14種程序性細胞死亡相關的基因钙畔，生成多基因特征茫陆，包括凋亡、壞死刃鳄、熱凋亡盅弛、鐵凋亡和杯狀凋亡。Bulk和單細胞RNA轉錄組數(shù)據(jù)集被用于開發(fā)和驗證該模型。作者通過Western印跡挪鹏、共免疫沉淀（Co-IP）见秽、LDH釋放試驗、CCK-8和遷移試驗評估了ESCC細胞中兩個壞死相關基因的功能讨盒，然后對ESCC患者樣本（67人）進行了免疫組化（IHC）染色解取。作者構建的CCDI模型具有預測癌癥預后和對ICIs反應的潛力。CCDI 模型中的 HOOK1 和 CUL4A 在 ESCC 中可能具有關鍵的調控作用返顺，是 ESCC 的潛在治療靶點和預后生物標志物禀苦。

本篇文章還可以進一步升級，例如基于13種細胞死亡模式的的評分進行分型遂鹊，后續(xù)結合百種機器學習建模振乏。或者將細胞死亡換成代謝等其他方向秉扑。

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研究流程：

首先慧邮，作者從已發(fā)表的文獻和數(shù)據(jù)庫中收集了14種細胞死亡形式的特征基因組，包括細胞凋亡（內在和外在）舟陆、內生性細胞死亡误澳、壞死性細胞死亡、杯突性細胞死亡秦躯、氧化性細胞死亡忆谓、鐵突性細胞死亡、堿突性細胞死亡踱承、熱突性細胞死亡倡缠、parthanatos、自噬依賴性細胞死亡茎活、溶酶體依賴性細胞死亡毡琉、網(wǎng)狀細胞死亡和ICD。研究流程圖見圖1a妙色。

研究結果：

鑒定與14種細胞死亡形式相關的基因并建立預后特征基因組

作者使用單變量Cox回歸從14種PCD共3518個基因中篩選出與OS顯著相關的基因桅滋，然后利用多變量Cox回歸生成每種細胞死亡形式的預后基因特征。圖1b-o比較了正常組織和腫瘤組織中每個預后特征基因的表達水平身辨，然后用匹配森林圖總結了多變量Cox回歸分析的結果丐谋。

評估14個預后模型和CCDI模型

作者繪制了14個預后模型隨時間變化的ROC（圖2a）。1年煌珊、2年号俐、3年、4年和5年AUC>0.7的95%置信區(qū)間下限的預后模型被用于合并分析定庵。在包含2-4個單獨預后特征的各種組合模型中吏饿，將ICD（AUC=0.800）和壞死（AUC=0.803）結合起來的模型踪危，即組合細胞死亡指數(shù)（CCDI），顯示出最高的預測準確性（AUC=0.834）（圖2b）猪落。CCDI由16個基因組成（KIF11贞远、MTOR、PIK3R1笨忌、TSC1蓝仲、HOOK1、ALK官疲、CEACAM1袱结、VIM、CCND1途凫、DPP4垢夹、NGFR、RPS24维费、MEFV棚饵、CLU4A、RARG和SRC）掩完。隨時間變化的ROC曲線見圖2c。

Kaplan-Meier生存曲線（圖2d）和UMAP降維（圖2e）顯示硼砰，與單獨使用ICD或壞死模型相比，CCDI能更好地區(qū)分預后良好和預后不良的患者恶阴。此外豹障，還繪制了精確度-召回曲線（PRC）（圖2f）冯事。壞死和ICD風險評分之間存在相關性昵仅，CCDI隨著壞死和ICD風險評分的增加而增加（圖2g）。最后累魔，作者繪制了基因與ICD吕世、壞死和CCDI模式的關聯(lián)圖命辖。中心的深藍色尔许、綠色和紅色斑點分別代表壞死、ICD和CCID模型毡们，灰色線條連接相關基因（圖2h）。線的粗細與每個基因的表達水平和相應預后模型的風險評分之間的相關性以及ICD红氯、壞死和CCDI模型之間關于風險評分的相關性成正比（圖2h）。同樣塞栅，ROC曲線腔丧、Kaplan-Meier生存曲線和UMAP分析表明，在預測ESCC患者的預后方面砾医，CCDI優(yōu)于單純的壞死或ICD模型衣厘。

CCDI界定的高風險組和低風險組的免疫治療反應

為了探索CCDI模型對免疫治療敏感性的預測能力，作者分析了CCDI模型風險評分與51個免疫檢查點和調節(jié)因子之間的相關性怖亭。結果顯示兴猩，CCDI與廣泛的免疫相關基因顯著相關倾芝，表明CCDI模型具有潛在的免疫意義（圖3a）潭千。在訓練集（GSE53625）中應用TIDE算法預測對ICIs的反應刨晴，TIDE方法可以區(qū)分應答者（TIDE評分<0）和非應答者（TIDE評分>0）（圖3b）狈癞。皮爾遜相關分析表明，風險評分與TIDE評分呈正相關真竖，這意味著CCDI分值低的患者比CCDI分值高的患者更有可能對ICIs產(chǎn)生反應（圖3c）恢共。事實上，在同一隊列中，低風險組的應答者比例高于高風險組（圖3d）梢薪。

作者通過IMvigor210數(shù)據(jù)集進一步證實了CCDI預測ICIs反應的能力。根據(jù)多變量Cox回歸分析系數(shù)和CCDI基因的表達，計算出IMvigor210數(shù)據(jù)集中每位患者的CCDI評分瘦麸。CCDI評分大于0.64（早期生存分析中為訓練集設定的臨界值）的患者被歸入高風險組滋饲，其余患者被歸入低風險組箍鼓。Kaplan-Meier分析顯示，與高CCDI患者相比铐殃，低CCDI患者的生存期明顯延長（圖3e）背稼。作者發(fā)現(xiàn)低風險組達到CR或PR的患者比例高于CCDI定義的高風險組（圖3f）。此外帘腹，CR或PR組患者的平均CCDI低于PD組患者（圖3g）。作者還在GSE78220隊列中驗證了CCDI對接受抗PD-1療法（pembrolizumab和nivolumab）治療的黑色素瘤患者的預測價值球化。與高風險組相比，低風險組中對抗擊PD-1療法有反應的患者相對較多（圖3h和i）巢掺。同樣，就腎細胞癌而言轧苫，作者觀察到CCDI低的患者更有可能從抗PD-1治療中獲益钾军，而有反應者（GSE67501）的CCDI更低（圖3j和k）。綜上所述樱哼，這些結果表明，低風險患者對ICIs更為敏感茄唐，這意味著CCDI可能可以預測不同類型癌癥對ICIs的敏感性。

利用單細胞RNA轉錄組建立ESCC細胞圖譜

作者利用已發(fā)表的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)（GSE196756）進一步分析了CCDI基因的重要性。經(jīng)過多重質量控制和過濾步驟相嵌，作者從36,515個單細胞中獲得了包含24,171個基因的表達矩陣。利用典型的單個標記基因看铆，作者將所有細胞分為八大細胞類型纬傲，包括上皮細胞（上皮細胞和ESCC細胞）算墨、免疫細胞（T細胞报咳、B細胞暑刃、單核細胞和樹突狀細胞）、基質細胞（成纖維細胞和內皮細胞）和紅細胞（圖4a和b）。在配對的正常組織和腫瘤組織中谷扣，上皮細胞、免疫細胞和基質細胞的比例差異很大（圖4c）在塔。

接下來篱蝇，細胞間通訊分析結果顯示麸塞，ESCC細胞與免疫細胞和基質細胞有重要的相互作用（圖4d和e）。利用Cell Chat算法雁比，作者推算了TME中不同類型細胞的傳入和傳出信號。作為信號發(fā)送者茴她，各種細胞都能合成和分泌各種細胞因子或配體祭钉；同時，作為信號接收者遂铡，它們還能通過受體感知細胞外配體。圖4f展示了不同類型細胞間溝通的關鍵信號∽谡欤總之，TME中不同類型細胞間配體與受體的相互作用凸顯了各細胞亞群對腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要性。

識別細胞狀態(tài)轉變過程中的動態(tài)CCDI基因

接下來，通過對GSE196756數(shù)據(jù)集的進行擬時序分析，作者試圖研究CCDI基因是否有助于浸潤免疫細胞稻爬、基質細胞和ESCC細胞的發(fā)育軌跡。首先竞滓，使用"singleR"包和已發(fā)表研究中收集的標記基因將七個細胞群劃分為不同的子集（圖5a-g上部）厢塘。作者使用"Monocle2"包根據(jù)細胞亞型對原始組內的細胞進行排序抓半，以確定它們的單細胞運動軌跡。每個細胞群的時間線軌跡起點用箭頭表示（圖5a-g中部）探入。作者發(fā)現(xiàn)，PIK3R1、RPS24和VIM的水平隨著T細胞的分化過程而動態(tài)變化（圖5b下部）隆嗅，這表明這些基因可能與這些細胞的命運決定有某種關系±龊福總之，作者發(fā)現(xiàn)RPS24和VIM無論如何都可能調控所有分析細胞群的細胞狀態(tài)。此外馋没，細胞周期蛋白D1（CCND1）也可能在成纖維細胞和內皮細胞的動態(tài)轉變過程中發(fā)揮特殊作用（圖5e和f）。作者還注意到声旺，CUL4A與ESCC細胞的分化過程有關（圖5g）腮猖。

接下來，作者獲得了ESCC的TCR-seq數(shù)據(jù)集（GSE188900）對T細胞進行進一步分析赞枕，該數(shù)據(jù)集包含從52,772個單細胞中檢索到的23,160個基因的表達矩陣缚够，證實了RPS24、VIM和PIK3R1在細胞命運決策中的重要性（圖6）鹦赎。對此數(shù)據(jù)集的分析表明，除了CUL4A外古话，HOOK1也可能對ESCC細胞的轉化至關重要（圖6g）

HOOK1和CUL4A的體外功能分析

鑒于HOOK1和CUL4A在ESCC預后中的功能意義以及生物信息學分析所揭示的對腫瘤細胞命運的調控雏吭，作者研究了HOOK1和CUL4A的體外功能。作者檢測了HOOK1和CUL4A在食管上皮細胞和ESCC細胞系中的表達水平陪踩。HOOK1和CUL4A水平相對較低的KYSE150和KYSE410細胞被用于功能增益分析（圖7a）杖们。作者進行了RT-qPCR（圖7b，上圖）和Western印跡（圖7b肩狂，下圖）檢測摘完，以確認基因操作的效率。接下來傻谁，作者證明順鉑可誘導ESCC細胞壞死（圖7c）孝治，并將其用作壞死誘導劑。HOOK1的異位表達誘導ESCC細胞壞死审磁，表現(xiàn)為RIPK1谈飒、p-RIPK3和p-MLKL水平的升高，而幾種壞死抑制劑态蒂，如necrostain-1（Nec-1）杭措、強效抗MLKL藥物新磺酰胺（NSA）和更特異的抗pRIPK1藥物RIPA-56都能以濃度依賴性的方式減弱壞死（圖7d-f）。

壞死的標志是形成由RIPK1和RIPK3組成的復合物--壞死體钾恢，以及MLKL的招募和磷酸化手素。作者的Co-IP結果表明考传，強化表達HOOK1會促進RIPK1底桂、RIPK3和MLKL的相互作用坝茎，這表明ESCC細胞中的壞死體復合物增加了（圖7g）譬淳。此外，過表達CUL4A可減少壞死體的形成（圖7h）祠斧。這些數(shù)據(jù)進一步證實了HOOK1和CUL4A促進和減少了ESCC細胞的壞死。LDH檢測證實拱礁，HOOK1過表達介導的細胞損傷可被Nec-1琢锋、NSA和RIPA-56逆轉（圖7i-k），而CUL4A過表達可顯著減少順鉑誘導的ESCC細胞壞死（圖7l）呢灶，這表明這兩個基因調控壞死吴超。此外，作者還研究了HOOK1和CUL4A對ESCC細胞增殖和遷移的影響鸯乃。通過CCK鲸阻、跨孔遷移和傷口愈合實驗，強制表達HOOK1抑制了ESCC細胞的增殖和遷移（圖7m,o,q）缨睡，而CUL4A則對癌細胞產(chǎn)生了相反的影響（圖7n,p,r）鸟悴。這些結果揭示了HOOK1和CUL4A在ESCC細胞中分別通過調控癌細胞壞死、增殖和遷移而抑制和促進腫瘤的潛能奖年。

臨床樣本中CUL4A和HOOK1的驗證

此外细诸，作者還驗證了這兩個基因在ESCC患者樣本中的表達。Western印跡結果顯示陋守，與12例患者的匹配腫瘤組織相比震贵，HOOK1在瘤周組織中高表達。與此同時水评，CUL4A的表達呈反向趨勢猩系，表明該基因具有促進腫瘤生長的潛能（圖8a）。作者還對67例ESCC患者的腫瘤組織和10例腫瘤周圍組織進行了免疫組化（IHC）染色（圖8b和c）中燥。結果發(fā)現(xiàn)寇甸，HOOK1主要定位于上皮細胞的胞漿中，而在瘤周組織中則下調（圖8b疗涉、d）幽纷。

此外，與高分化腫瘤相比博敬，低/中分化腫瘤的HOOK1表達水平進一步降低（圖8e）友浸，且與臨床分期無關（圖8f）。CUL4A存在于上皮細胞的細胞核和細胞質中偏窝，并在腫瘤組織中上調（圖8c收恢，h）武学。CUL4A與ESCC的分化程度和臨床分期無關（圖8i和j）。此外伦意，ESCC患者的HOOK1或CUL4A表達水平被二分火窒。Kaplan-Meier生存率分析表明，HOOK高表達腫瘤患者的生存率明顯優(yōu)于HOOK低表達腫瘤患者（圖8g）驮肉。

相比之下熏矿，CUL4A高表達患者的預后比基因低表達患者差（圖8k）。綜合分析表明离钝，HOOK低/CUL4A高表達的ESCC患者的OS最差（圖8l）票编。單變量和多變量COX回歸分析確定HOOK1（圖8m）是ESCC預后的獨立預測因子÷芽剩總之慧域，這些結果再次證實了HOOK1和CUL4A在ESCC的發(fā)展中起著至關重要的作用。

研究總結：

作者結合免疫原性細胞死亡（ICD）和壞死標志浪读，建立并驗證了16個基因的預后聯(lián)合細胞死亡指數(shù)（CCDI）昔榴。正如腫瘤免疫功能紊亂和排斥（TIDE）分析所顯示的那樣，CCDI還能預測癌癥患者對ICIs的反應碘橘，并在四項獨立的ICI臨床試驗中得到證實互订。軌跡分析顯示，HOOK1和CUL4A可能會影響ESCC細胞的命運痘拆。作者發(fā)現(xiàn)屁奏，HOOK1誘導壞死，抑制ESCC細胞的增殖和遷移错负，而CUL4A則表現(xiàn)出相反的作用坟瓢。Co-IP分析證實，HOOK1和CUL4A促進和減少了ESCC細胞中壞死體的形成犹撒。來自ESCC患者的數(shù)據(jù)進一步證實折联，HOOK1和CUL4A可能分別是腫瘤抑制因子和致癌基因。