一宾巍、高通量測序平臺第一個(gè)測序技術(shù)——焦磷酸測序
- 基本過程：建庫——信號放大（PCR）——測序竟坛。
- 兩種接頭序列灾测，其中一種含有生物素，可以用鏈霉親和素磁珠捕獲和分離禁熏。
- 通過變性將不帶生物素標(biāo)記的序列洗脫壤巷。
- emulsion PCR（乳液PCR）——油包水結(jié)構(gòu)。
二瞧毙、454文庫制備方式
1胧华、短片段末端配對文庫制備（Short Pair End library preparation）
- 打斷后的gDNA進(jìn)行EcoR I位點(diǎn)甲基化修飾。
- 引入特定接頭——同時(shí)帶“EcoRⅠ”位點(diǎn)宙彪、“MmeⅠ”酶切位點(diǎn)和生物素矩动。
- gDNA中的EcoRⅠ位點(diǎn)由于甲基化修飾而不能被酶切消化，保證基因組結(jié)構(gòu)完整释漆；而接頭的EcoRⅠ位點(diǎn)被酶切悲没，產(chǎn)生粘性末端進(jìn)行環(huán)化，含有生物素標(biāo)記男图。
- 在接頭上再進(jìn)行MmeⅠ的酶切將環(huán)狀分子打開檀训，只保留了具有internal接頭的序列柑潦，再進(jìn)行接頭連接。
- 最后測序的兩端序列在比對回基因組上的物理距離即是起始打斷長度峻凫。
2渗鬼、長片段末端配對文庫制備（Long Pair End library preparation）
- DNA分子打斷： ~20k、 ~8k荧琼、 ~3k 譬胎。
- 接頭有l(wèi)oxp位點(diǎn)——具有方向性，可產(chǎn)生粘性末端命锄，只有正確加入的接頭才可以進(jìn)行環(huán)化堰乔，未環(huán)化部分——即線性分子，會被線性酶切酶消化脐恩。
- 測序后的末端序列比對回基因組上的長度分別為20k镐侯、8k、3k驶冒。
三苟翻、序列特征
- 兩端primer——PCR primer和Sequencing primer。
- 454特有key序列（TCAG）——用于信號校正骗污。
- MID序列——每個(gè)分子獨(dú)有一個(gè)MID序列（標(biāo)簽）崇猫，識別每個(gè)分子來源，以減輕PCR duplication的影響需忿。
四诅炉、emPCR
- 單鏈文庫和beads進(jìn)行結(jié)合，加入礦物油高速震蕩屋厘，獲得乳化油包水體系：
一個(gè)beads一個(gè)分子——理想型涕烧；
一個(gè)beads多條分子；
只有分子汗洒；
只有beads澈魄； - 經(jīng)過擴(kuò)增可獲得數(shù)十萬條固定化的單克隆模板。
五仲翎、454測序技術(shù)原理
在DNA聚合酶痹扇、ATP硫酸化酶和熒光素酶的作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來溯香，通過檢測化學(xué)發(fā)光信號的有無和強(qiáng)度鲫构，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測DNA序列的目的。
焦磷酸測序法：每合成1分子的核苷酸玫坛，即釋放1分子的焦磷酸（PPi）和過硫酸銨（APS）在硫酸化酶（Sulfurylase）催化下釋放出ATP结笨，ATP提供能量使熒光素（luciferin）在酶催化下氧化并釋放出光信號被CCD識別而完成一個(gè)循環(huán)的測序反應(yīng)。
- 以key序列四種堿基信號為基準(zhǔn)判斷判斷堿基數(shù)量和類型，信號不足1mer的堿基信號的會判為噪音炕吸。
- 454在二代測序中讀長最長伐憾。
