Nat Bio | 構(gòu)象鎖定抗體“鉗夾”用于KRAS抑制劑的發(fā)現(xiàn)

原創(chuàng)?蘇安?圖靈基因?2022-01-20 09:12

收錄于話題#前沿分子生物學(xué)技術(shù)

撰文：蘇安

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對于藥代動力學(xué)中難以處理的蛋白質(zhì)問題构眯，穩(wěn)定非活性蛋白質(zhì)構(gòu)象的小分子是一種未被充分利用的策略。為了便于這類抑制劑的發(fā)現(xiàn)和表征渔期，研究人員創(chuàng)建了一個(gè)篩選平臺來識別分子探針(CLAMPs)的構(gòu)象鎖定抗體，以區(qū)分和誘導(dǎo)罕見的蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)批旺。將該方法應(yīng)用于KRAS访递，研究人員發(fā)現(xiàn)了識別由共價(jià)抑制劑穩(wěn)定的KRASG12C的開放構(gòu)象的clamp份氧。一個(gè)鉗夾可以在體內(nèi)顯示KRASG12C共價(jià)修飾，并可用于研究患者腫瘤中對KRASG12C抑制劑的反應(yīng)異質(zhì)性诗茎。第二個(gè)鉗夾通過穩(wěn)定KRASG12C的特定構(gòu)象工坊，增強(qiáng)了與KRASG12C開關(guān)II區(qū)域(SWII)結(jié)合的弱配體的親和力，從而能夠發(fā)現(xiàn)這些配體敢订，可以作為高通量篩選藥物開發(fā)的先導(dǎo)王污。研究表明，結(jié)合抗體和小分子的互補(bǔ)特性有助于動態(tài)蛋白的研究和用藥楚午。

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蛋白質(zhì)通常以一系列構(gòu)象狀態(tài)的形式存在來執(zhí)行其功能昭齐，擾亂這些構(gòu)象也可能會導(dǎo)致疾病。小分子抑制劑能夠捕獲這些動態(tài)蛋白質(zhì)矾柜，為許多疾病提供了潛在的治療方法阱驾，但由于蛋白質(zhì)固有的構(gòu)象靈活性，這些小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)仍然具有挑戰(zhàn)性怪蔑。小分子抑制劑需要與動態(tài)的蛋白質(zhì)發(fā)生高親和力的結(jié)合才有效里覆，但文庫篩選的策略難以篩選到高親和力的小分子抑制劑。合成單克隆抗體(mAbs)是一種新興的工具缆瓣，可以穩(wěn)定獨(dú)特的蛋白質(zhì)構(gòu)象喧枷，并提高構(gòu)象鎖定靶點(diǎn)結(jié)合的能力，從而能夠發(fā)現(xiàn)針對RAS弓坞、caspases和GPCRs1-5的構(gòu)象傳感器隧甚。然而，因?yàn)闆]有能夠鎖定特定構(gòu)象的小分子昼丑，并且還沒有強(qiáng)大的工具將其整合到單抗中呻逆，所以這些單克隆抗體仍然罕見夸赫。

近期菩帝，在Nature Biotechnology雜志上發(fā)表了一篇名為“Conformation-locking antibodies for the discovery and characterization of KRAS inhibitors”的文章，本文的研究人員建立了一個(gè)抗體平臺來識別構(gòu)象鎖定抗體的分子探針茬腿，他們稱之為鉗夾呼奢。研究人員將該平臺應(yīng)用于共價(jià)修飾的KRASG12C中，發(fā)現(xiàn)了兩類CLAMPs切平。其中一種鉗夾可以在單個(gè)癌細(xì)胞和腫瘤中檢測共價(jià)修飾的KRASG12C握础，為KRASG12C抑制劑介導(dǎo)的靶點(diǎn)參與提供了一個(gè)直接的生物標(biāo)記物，并可以與RAS通路標(biāo)記物結(jié)合悴品，在細(xì)胞水平上評估通路抑制和隨后的反彈禀综。其他claps也表現(xiàn)出對KRASG12C-GDP的親和力简烘，在沒有配體的情況下，一個(gè)鉗夾穩(wěn)定SWII口袋的開放構(gòu)象定枷。這一特性大大提高了多種非共價(jià)抑制劑對KRASG12C和KRASWT的親和力孤澎，并使通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)新的SWII口袋配體成為可能。研究人員認(rèn)為KRAS CLAMPs是研究KRASG12C共價(jià)修飾的重要生物學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)工具欠窒，將為識別靶向KRAS SWII口袋的化學(xué)物質(zhì)提供一個(gè)獨(dú)特的平臺覆旭。

為了發(fā)現(xiàn)KRAS SWII口袋的CLAMPs并且對其進(jìn)行特性分析。作者開發(fā)了一種利用合成抗體庫的體外選擇策略來鑒定KRAS CLAMPs的方法岖妄。并將這種方法應(yīng)用于KRAS型将，KRAS在其switI(SWI)和SWII區(qū)域表現(xiàn)出構(gòu)象異質(zhì)性，以識別能夠穩(wěn)定與KRASG12C共價(jià)抑制劑誘導(dǎo)的開放SWII口袋構(gòu)象兼容的抗體荐虐。為了鑒定KRAS CLAMPs七兜，作者利用了KRASG12C的不同構(gòu)象：未修飾的KRASG12C-GDP、KRASG12C-GDP與共價(jià)抑制劑和KRASG12C-GMPPCP(不可水解的GTP模擬物)福扬，進(jìn)行了4輪生物篩選惊搏。為了驅(qū)動形成共價(jià)抑制KRASG12C-GDP的獨(dú)特構(gòu)象，作者在溶液中存在過量的KRASG12C-GDP和KRASG12C-GMPPCP的情況下進(jìn)行選擇忧换。為了發(fā)現(xiàn)能夠在沒有抑制劑的情況下穩(wěn)定開放SWII口袋構(gòu)象的抗體恬惯，作者還用KRASG12C-GDP+GNE-1952進(jìn)行了三輪篩選，然后用KRASG12C-GDP進(jìn)行了第四輪篩選亚茬。通過噬菌體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)確定特異性酪耳，作者生成了11個(gè)獨(dú)特克隆的IgGs，并通過ELISA和表面等離子體共振對其結(jié)合特異性進(jìn)行了表征刹缝。圖1.KRAS CLAMPs的發(fā)現(xiàn)和表征

由于與KRASG12C-GDP相比碗暗，1A5鉗對共價(jià)修飾的KRASG12C-GDP具有最高的特異性，為了追蹤細(xì)胞中的KRASG12C共價(jià)修飾梢夯，我們檢測了1A5鉗是否能特異性檢測細(xì)胞中抑制劑結(jié)合的KRASG12C言疗。免疫熒光染色1A5鉗檢測各種KRASG12C共價(jià)抑制劑，包括GNE-1952颂砸，ARS-853噪奄，ARS-1620和AMG510，從而證實(shí)了1A5識別各種KRASG12C共價(jià)抑制劑誘導(dǎo)的共同三維表位的能力人乓。ARS-1620處理的HCC1171細(xì)胞中的1A5鉗染色強(qiáng)度似乎與劑量和時(shí)間有關(guān)勤篮，與共價(jià)抑制KRASG12C的免疫印跡結(jié)果一致。免疫熒光染色的結(jié)果顯示色罚，細(xì)胞中KRASG12C的ARS-1620共價(jià)修飾在細(xì)胞的質(zhì)膜和點(diǎn)狀隔間中均以相當(dāng)同步的方式發(fā)生碰缔。由于不存在RAS-GDP特異性抗體，1A5鉗夾染色可能提供了KRASG12C-GDP在細(xì)胞中的定位信息戳护。此外金抡，1A5鉗位染色的均勻性和動力學(xué)表明瀑焦，KRASG12C的共價(jià)修飾可能與細(xì)胞周期階段無關(guān)。由于KRASG12C-GDP的共價(jià)修飾依賴于內(nèi)在的GTP水解梗肝，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明蝠猬，內(nèi)在的KRASG12C-GTP水解也不依賴于細(xì)胞周期，并且突出了1A5鉗檢測共價(jià)修飾KRASG12C-GDP的敏感性统捶。圖2.1A5鉗可以在多種細(xì)胞檢測中監(jiān)測KRASG12C共價(jià)修飾

作者還調(diào)查了一套市售的KRAS抗體榆芦，以確定其構(gòu)象特異性。他們通過免疫沉淀和ELISA鑒定了兩種與KRASG12C親和力相當(dāng)?shù)目贵w(EP1125Y和Ras10)喘鸟，無論是否進(jìn)行共價(jià)修飾匆绣，表明這些抗體對共價(jià)修飾誘導(dǎo)的構(gòu)象沒有特異性。相比之下什黑，據(jù)報(bào)道對HRAS-GTP具有高度特異性的iDab抗體很少或沒有與共價(jià)修飾的KRASG12C-GDP結(jié)合崎淳，但通過ELISA與KRASG12GC-GDP和KRASG12C-GMPPCP結(jié)合和免疫沉淀研究。由于iDab抗體結(jié)合了一個(gè)同時(shí)跨越SWI和SWII區(qū)域的表位愕把，由KRASG12C-GDP共價(jià)修飾誘導(dǎo)的SWII構(gòu)象可能阻止了iDab的結(jié)合拣凹。因?yàn)?A5鉗和iDab的互補(bǔ)特異性，作者為了確定1A5鉗和iDab抗體是否可以聯(lián)合用于協(xié)同使用恨豁，并在同一細(xì)胞內(nèi)觀察未修飾和共價(jià)修飾的KRASG12C嚣镜。他們對經(jīng)ARS-1620劑量滴定處理的HCC1171 KRASG12C細(xì)胞進(jìn)行了1A5鉗夾和iDab抗體的IF實(shí)驗(yàn)。與之前使用1A5進(jìn)行的IF實(shí)驗(yàn)相似橘蜜，作者檢測到1A5染色的增加菊匿，這與高濃度的ARS-1620處理相關(guān)。此外计福，1A5染色增加與iDab抗體染色減少相一致跌捆，證實(shí)了這兩種抗體染色出的KRASG12C構(gòu)象不同。作者將兩種抗體共染色象颖，監(jiān)測到KRASG12C的重新合成佩厚。藥物洗脫后，免疫印跡分析顯示说订，修飾的KRASG12C早在6小時(shí)就明顯出現(xiàn)抄瓦，并在24h時(shí)增加，1A5染色顯著克蚂，減少闺鲸，IF顯示iDab抗體染色增加筋讨。圖3.一種使用1A5鉗夾的雙抗體檢測和一種文獻(xiàn)抗體同時(shí)跟蹤未結(jié)合和共價(jià)修飾的KRASG12C

接下來埃叭，作者試圖確定1A5鉗夾是否可以在人腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)中檢測到共價(jià)修飾的KRASG12C。他們使用福爾馬林固定石蠟包埋組織的免疫組化檢測1A5鉗共價(jià)抑制KRASG12C悉罕，結(jié)果顯示陰性赤屋，這可能是由于福爾馬林處理破壞了1A5鉗識別的構(gòu)象表位立镶。然而，ARS-1620共價(jià)修飾的KRASG12C很容易在未固定的新鮮冷凍組織中被IHC檢測到类早。此外媚媒，研究人員觀察到，與50mgkg-1處理相比涩僻，100mg-1處理的樣品染色更強(qiáng)的染色趨勢缭召。通過1A5鉗夾，也可以檢測到表達(dá)由ARS-1620共價(jià)修飾的少量KRASG12C的腫瘤逆日。

與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)類似嵌巷，1A5鉗在體外腫瘤樣本的熒光激活細(xì)胞分選儀實(shí)驗(yàn)中，檢測到被ARS-1620共價(jià)修飾的KRASG12C室抽，并可與pS6結(jié)合搪哪。這些結(jié)果表明，在KRASG12C突變腫瘤樣本中1A5鉗可以測量KRASG12C抑制劑的直接靶點(diǎn)接觸坪圾，并且利用RAS通路激活標(biāo)記物進(jìn)行單細(xì)胞分析晓折。圖4.KRAS鉗可以檢測經(jīng)ARS-1620處理的高、低表達(dá)和低KRASg12c的小鼠異種移植物中共價(jià)修飾的KRASG12C

為了對鉗夾復(fù)合物CLAMP-KARSg12c進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析兽泄。作者測定了KRASG12C-GDP與2H11片段抗原結(jié)合(Fab)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)是2.2a分辨率的漓概。結(jié)果表明，2H11Fab不是與KRASG12CSWII口袋結(jié)合病梢，而是接觸SWII區(qū)域的外表面垛耳，以變構(gòu)的方式穩(wěn)定口袋的開放構(gòu)象。2H11Fab互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)H1和H3參與了與KRASG12C的大部分直接接觸飘千。CDRL2和H2也提供了一些與KRAS的范德華接觸堂鲜。CDRL2接觸到SWII螺旋的n端尖端，為SWII環(huán)提供了額外的穩(wěn)定护奈，但沒有過度限制SWII的構(gòu)象缔莲。SWII最靈活的部分Gln60-Ala66完全不與2H11直接接觸，保持了口袋內(nèi)的靈活性霉旗。SWII口袋具有穩(wěn)定的痴奏、開放的構(gòu)象，類似于之前發(fā)表的與配體結(jié)合的KRAS結(jié)構(gòu)厌秒，這表明配體很容易結(jié)合读拆。圖5.2H11鉗夾穩(wěn)定SWII口袋，并結(jié)合多個(gè)KRAS突變蛋白鸵闪。

鑒于2H11可以穩(wěn)定SWII口袋并顯著增強(qiáng)弱配體的結(jié)合檐晕，我們推斷這種鉗夾將使KRASG12C-GDPSWII口袋的片段先導(dǎo)發(fā)現(xiàn)。我們篩選了在2H11存在下的3060個(gè)化合物的片段庫，用KD<1辟灰、500μM鑒定出了其中3.3%的化合物个榕。其中三分之一的化合物在2H11的存在下顯示出KD<500μM。此外芥喇，在2H11存在的情況下西采，片段篩選導(dǎo)致的總命中率增加了兩倍，而KD<500μM的片段數(shù)量增加了13%继控，突出了2H11鉗位能夠發(fā)現(xiàn)弱配體的能力械馆。然后，我們測定了在2H11的情況下武通，GNE-2897和GNE-9764對KRASG12C的親和力狱杰。在2H11存在下，GNE-2897和GNE-9764對KRASG12C的結(jié)合親和力在KD=600和1,200μM之間相比之下厅须，在沒有2H11的情況下仿畸，兩種配體對KRASG12C都沒有任何顯著的親和力。接下來朗和，我們求解了GNE-2897與KRASG12C-GDP-2H11結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)错沽。我們發(fā)現(xiàn)GNE-2897結(jié)合在SWII口袋的后面，該位點(diǎn)通常被共價(jià)抑制劑占據(jù)眶拉。值得注意的是千埃，GNE-2897與最近發(fā)表的一種有效的KRASG12C-GDP共價(jià)抑制劑相似，表明2H11鉗夾可用于識別新的忆植、不同的片段放可，這些片段可以進(jìn)一步優(yōu)化成新的引物。圖6.2H11鉗夾可以發(fā)現(xiàn)弱親和力的SWII配體

作者通過生物學(xué)和物理結(jié)構(gòu)的結(jié)果表明朝刊，2H11鉗可以在KRASG12C-GDP中誘導(dǎo)具有SWII口袋的開放構(gòu)象耀里，可以提高SWII配體的親和力，并可能使未來在KRAS突變體中更廣泛地靶向該口袋拾氓。盡管取得了這些成功冯挎，但其他KRAS突變體是否可以通過SWII口袋進(jìn)行靶向仍有待確定。這些研究揭示了KRAS共價(jià)修飾的新見解咙鞍，并可用于在細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤模型中可視化和跟蹤抑制劑結(jié)合的KRASG12C房官。這些發(fā)現(xiàn)對于動態(tài)蛋白的藥物研究具有重要的意義。

教授介紹：

Marie Evangelista

Marie Evangelista,腫瘤學(xué)首席科學(xué)家续滋，博士后導(dǎo)師翰守。2003年在加拿大皇后大學(xué)獲得博士學(xué)位，2004年加入Genetech擔(dān)任博士后研究員疲酌，2009年被聘為首席科學(xué)家蜡峰。Genetech是世界上為數(shù)不多的進(jìn)行突破性基礎(chǔ)科學(xué)研究并將這些知識轉(zhuǎn)化為藥物的研究所之一。Marie Evangelista的工作是專注于腫瘤學(xué)中一些最具有挑戰(zhàn)性且重要的目標(biāo)，主要包括細(xì)胞周期檢查點(diǎn)事示，腫瘤靶向藥物早像，細(xì)胞應(yīng)激等研究僻肖。

參考文獻(xiàn)：

Marie Evangelista,?et al. Conformation-locking antibodies for thediscovery and characterization of KRAS inhibitors?[J].Naturebiotechnology. 2022 Jan 7: