酶工程復(fù)習(xí)小結(jié)

第一章 緒論

1.酶的發(fā)展史

?????? 1773年，意大利斯帕蘭扎尼發(fā)現(xiàn)了鷹的胃液消化肉塊卒废。

?????? 19世紀(jì)歐洲發(fā)現(xiàn)酶的反應(yīng)屬于化學(xué)反應(yīng)里逆，與生命活動(dòng)無(wú)關(guān)娇妓。

?????? 巴斯德發(fā)現(xiàn)發(fā)酵與活細(xì)胞有關(guān)肛根，起發(fā)酵作用的是酵母細(xì)胞辫塌。

?????? 庫(kù)恩將其命名為酶。

?????? 畢希納發(fā)現(xiàn)是一種生物反應(yīng)催化劑派哲。

酶的本質(zhì)研究：最初認(rèn)為酶是釀酒酵母臼氨，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是一種具有生物催化活性的物質(zhì)，在后來(lái)發(fā)現(xiàn)酶是一種蛋白質(zhì)芭届，在后來(lái)發(fā)現(xiàn)有些酶是RNA储矩。

?????? ?生物催化劑（Biocatalytics）：通常把來(lái)源于生物并且具有催化活性的酶制劑統(tǒng)稱為生物催化劑。生物催化劑除了從生物體分離出來(lái)的酶之外褂乍，還包括富含酶制劑的細(xì)胞碎片持隧、細(xì)胞器、喪失生命活性的完整細(xì)胞器以及可以增值的活細(xì)胞树叽。

?????? 酶工程是利用酶催化的作用舆蝴，在一定的生物反應(yīng)器當(dāng)中將原料轉(zhuǎn)化為所需要產(chǎn)品谦絮，是酶學(xué)理論與微生物技術(shù)的結(jié)合而產(chǎn)生的一門新技術(shù)题诵，是酶的生產(chǎn)與應(yīng)用過(guò)程技術(shù)。

?????? 酶的生產(chǎn)：通過(guò)各種方法獲得人們所需要的酶的技術(shù)過(guò)程层皱。

?????? 酶的應(yīng)用：通過(guò)酶的催化作用獲得人們所需要的物質(zhì)或者除去不需要的物質(zhì)的技術(shù)過(guò)程性锭。在酶的應(yīng)用過(guò)程當(dāng)中，出現(xiàn)了天然酶的缺陷包括：穩(wěn)定性差（對(duì)熱強(qiáng)酸強(qiáng)堿）叫胖、酶的分離純化技術(shù)復(fù)雜草冈、只能使用一次。

???? 酶的改良：通過(guò)各種技術(shù)和方法改良酶的催化特征的技術(shù)過(guò)程瓮增。包括酶的分子修飾怎棱、酶的固定化、酶的非水相催化體系的建立以及酶的定向進(jìn)化绷跑。

?????? 酶工程的三個(gè)階段：

酶的提取分離階段（日本的高峰讓吉用米曲霉制備淀粉酶拳恋、Rohm動(dòng)物一張中提取出胃蛋白酶用于皮革洗滌和軟化、木瓜蛋白酶用于啤酒澄清砸捏、細(xì)菌淀粉酶用于紡織品退漿谬运。

?????? 酶的發(fā)酵生產(chǎn)階段：微生物液體深層發(fā)酵進(jìn)行淀粉—淀粉酶的改良隙赁。

?????? 工程全面化發(fā)展：易錯(cuò)PCR、DNA重排梆暖、基因家族重排伞访、高通量篩選、酶的定向進(jìn)化轰驳。

第二章 酶學(xué)知識(shí)

1.酶的分類與命名

酶的分類：可以分為蛋白酶和核酸類酶厚掷。其中蛋白類酶包括氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶滑废、水解酶蝗肪、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶六種蠕趁，核酸酶包括分子內(nèi)核酸酶（自我剪切和酶薛闪、自我剪接核酶）和分子間核酸酶（DNA、RNA俺陋、多肽豁延、氨基酸）。羊轉(zhuǎn)水裂一臉

酶的命名：習(xí)慣命名法：底物加反應(yīng)特性（蛋白酶腊状、淀粉酶）诱咏、催化反應(yīng)特征（水解酶）、加來(lái)源或特征（木瓜蛋白酶缴挖、堿性磷酸酶）

系統(tǒng)命名法：E.C.a.b.c.d

a表示大類即分類當(dāng)中的六類袋狞。

2.酶的組成和特點(diǎn)

單純酶是指簡(jiǎn)單酶，只有一種催化成分映屋，單純蛋白質(zhì)苟鸯，比如：脲酶、淀粉酶棚点、脂肪酶早处。蛋白質(zhì)的性質(zhì)決定了他的催化活性。

結(jié)合酶或全酶：是指由酶蛋白和輔助因子構(gòu)成的瘫析，輔助因子包括金屬離子和小分子物質(zhì)砌梆，其中小分子物質(zhì)又包括輔酶和輔基。輔酶結(jié)合比較松弛贬循，輔基結(jié)合比較緊密咸包。一般來(lái)說(shuō)，全酶的酶蛋白決定了底物的專一性杖虾，輔助因子決定了反應(yīng)的專一性烂瘫。

輔助因子的作用：

金屬離子

金屬離子的作用：催化作用，參與三元絡(luò)合物E-M-S的形成亏掀，穩(wěn)定蛋白構(gòu)象忱反。根據(jù)金屬離子與酶蛋白的結(jié)合程度可以分為兩種：金屬酶和金屬激活酶泛释。酶蛋白與金屬離子結(jié)合緊密，比如說(shuō)鐵離子/亞鐵離子温算、銅離子/亞銅離子怜校。金屬激酶：酶蛋白與金屬離子結(jié)合比較松散，在溶液中酶蛋白與這類離子結(jié)合而被激活注竿。

輔酶和輔基：

輔酶：是指與酶蛋白結(jié)合比較松散那的小分子有機(jī)物質(zhì)茄茁，通過(guò)透析方法可以除去。

輔基：以共價(jià)鍵與酶蛋白結(jié)合巩割，不能用透析方法除去裙顽，必須使用一定的化學(xué)處理才能夠?qū)⒐矁r(jià)鍵打開(kāi)。

酶的組成形式：?jiǎn)误w酶宣谈、寡聚酶愈犹、多酶復(fù)合體、多酶融合體闻丑。

單體酶：有一條肽鏈組成或者多條肽鏈通過(guò)二硫鍵鏈接形成的酶漩怎。

寡聚酶：由兩個(gè)或兩個(gè)以上的與亞基組成的酶。

多酶復(fù)合體：由幾種酶通過(guò)共價(jià)鏈接形成的復(fù)合體嗦嗡。其中每一個(gè)酶催化一種反應(yīng)所有反應(yīng)依次進(jìn)行勋锤。

多聚融合體：一條多肽鏈上鏈接有多種催化活性的酶，通常是由基因改造形成的侥祭。

酶的結(jié)構(gòu)：包括必需基團(tuán)叁执、結(jié)構(gòu)維持和活性部位（包括結(jié)合基因和催化基因）

3.酶催化

酶催化的特點(diǎn)：催化效率高、高特異性矮冬、酶活可調(diào)節(jié)（不同反應(yīng)條件下酶活不同）

催化反應(yīng)的機(jī)制：廣義的酸堿催化谈宛、共價(jià)催化

4.酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：研究酶促反應(yīng)的速率以及其影響因素的科學(xué)。

5.酶活力測(cè)定：反應(yīng)條件設(shè)計(jì)酶濃度欢伏、底物濃度入挣、反應(yīng)體系亿乳、條件硝拧、樣品、空白和對(duì)照葛假。

第三章 酶的蛋白合成

1.中心法則

2.蛋白表達(dá)的調(diào)控：

2.1胞內(nèi)蛋白和胞外蛋白的差異：

胞內(nèi)蛋白由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的核糖體形成障陶，一般來(lái)說(shuō)，不含信號(hào)肽聊训，不經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抱究、高爾基體的加工。胞外蛋白是存在于細(xì)胞外的基質(zhì)當(dāng)中带斑，由細(xì)胞合成之后分泌到胞外的蛋白質(zhì)鼓寺，絕大多數(shù)含有信號(hào)肽勋拟。

2.2操縱子、調(diào)控子妈候、信號(hào)肽敢靡、前肽。其中操縱子和信號(hào)肽位于目的基因上游苦银。

操縱子：操縱子包括啟動(dòng)基因啸胧、操縱基因以及結(jié)構(gòu)基因，三者緊密相連幔虏，操縱子是三者的總稱纺念。很多功能相關(guān)的基因前后鏈接成串，由一個(gè)共同的控制區(qū)進(jìn)行調(diào)控想括。常見(jiàn)的操縱子包括：乳糖操縱子陷谱、色氨酸操縱子等信號(hào)肽：蛋白質(zhì)中由特定氨基酸組成的連續(xù)序列，決定蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的最終定位瑟蜈。在胞外蛋白分泌的過(guò)程中至關(guān)重要叭首。

2.3密碼子：mRNA每三個(gè)相鄰堿基排列成為一個(gè)密碼子，密碼子決定氨基酸的種類踪栋，密碼子的排列順序決定氨基酸的排列順序焙格，進(jìn)而決定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。在翻譯過(guò)程中會(huì)與反密碼子相結(jié)合夷都。免疫原性：指可以引起免疫應(yīng)答的性能眷唉。即抗原刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞發(fā)生活化囤官、增殖冬阳、分化，最終產(chǎn)生特定的免疫細(xì)胞的能力党饮。

抗原性：抗原性是指抗原與其誘導(dǎo)的看抗體或致敏淋巴細(xì)胞他特異性結(jié)合的能力大小肝陪。

蛋白結(jié)構(gòu)包括一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)刑顺。

第四章 微生物產(chǎn)酶

1.微生物產(chǎn)酶的流程

1）菌種分離篩選：土樣采集氯窍、過(guò)濾、輔基蹲堂、菌落培養(yǎng)狼讨、篩選

2）菌種優(yōu)化培育

3）發(fā)酵培養(yǎng)基/發(fā)酵條件的優(yōu)化

4）發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化

5）酶制劑的包裝保存

2.微生物產(chǎn)酶的生化機(jī)制

1）酶的生物合成的基本過(guò)程：轉(zhuǎn)錄和翻譯

2）生物合成的調(diào)節(jié)：

?????? 分解代謝物的阻遏作用

?????? 酶生物合成的誘導(dǎo)作用

?????? 酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔?/p>

3）合成模式：同步合成型、延續(xù)合成型柒竞、中期合成型政供、滯后合成型。（合成模式并不是固定不變的，同一菌種在不同條件下的合成模式可能會(huì)不同布隔。）

同步合成型：酶的合成與細(xì)胞的生長(zhǎng)同步進(jìn)行离陶，在細(xì)胞進(jìn)入平衡期之后，酶的合成停止衅檀。

延續(xù)合成型：酶的合成與細(xì)菌的生長(zhǎng)同步進(jìn)行枕磁，但是在細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期之后，酶還可以繼續(xù)合成一段時(shí)間术吝。

中期合成型：酶在細(xì)菌生長(zhǎng)一段時(shí)間之后才開(kāi)始计济，在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平衡期之后，酶的合成停止排苍。

滯后合成型：酶合成在細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始一段時(shí)間后沦寂，在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平衡期之后，酶的合成還可以繼續(xù)合成一段時(shí)間淘衙。

3.微生物產(chǎn)酶的影響因素：

優(yōu)化菌株传藏、優(yōu)化培養(yǎng)基、優(yōu)化分離技術(shù)彤守、設(shè)備及條件毯侦、控制工藝、其他（添加誘導(dǎo)物具垫、控制阻遏物濃度侈离、添加表面活性劑、添加促進(jìn)劑）筝蚕。

誘導(dǎo)物：能夠調(diào)節(jié)啟動(dòng)子開(kāi)關(guān)的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)物卦碾，誘導(dǎo)物可以與調(diào)控蛋白結(jié)合，改變調(diào)控蛋白的空間結(jié)構(gòu)起宽，從而能改變基因轉(zhuǎn)錄翻譯洲胖。

阻遏物：一種可以與DNA或者RNA結(jié)合來(lái)阻遏轉(zhuǎn)錄翻譯的一種蛋白質(zhì)，與操縱基因結(jié)合之后影響操縱子的蛋白結(jié)構(gòu)坯沪，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成绿映。

表面活性劑：指具有一定的親水疏水基因，在溶液表面橫向排列腐晾，并且可以使表面張力下降的物質(zhì)叉弦。促進(jìn)劑：可以促進(jìn)產(chǎn)酶，但是并不清楚其原理赴魁。

因此卸奉，發(fā)酵方式的選擇钝诚、了解發(fā)酵特點(diǎn)颖御、培養(yǎng)基的選擇、優(yōu)化工藝、優(yōu)化發(fā)酵條件非常重要潘拱。

培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的C/N疹鳄，碳源、氮源有什么物質(zhì)提供芦岂、無(wú)機(jī)鹽瘪弓、生長(zhǎng)因子

發(fā)酵條件包括pH條件（緩沖體系、培養(yǎng)基中禽最、流體）腺怯、溫度（培養(yǎng)溫度、發(fā)酵罐溫度）川无、溶解氧（氧分壓呛占、通氣量、氣液接觸時(shí)間懦趋、接觸面積晾虑、改變培養(yǎng)液的性質(zhì)）。

4.微生物發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)：

1

）微生物產(chǎn)酶產(chǎn)量高仅叫。

2）微生物產(chǎn)酶穩(wěn)定下好帜篇。

3）利于培養(yǎng)和管理

4）利于酶的分離純化

5）安全可靠，無(wú)毒性诫咱。

第五章 微生物菌種改造

1.育種的分子生物學(xué)基礎(chǔ)——突變

突變的分子機(jī)制：基因突變（堿基替換笙隙、移碼突變、易位突變）坎缭，染色體畸變和染色體組變（缺失和重復(fù)逃沿、倒位和易位、多倍體三倍體）

遺傳性狀改變：同義和無(wú)義突變幻锁、錯(cuò)義突變凯亮、移碼突變

突變類型：形態(tài)突變型、生化突變型哄尔、條件致死突變型假消、致死突變型、抗性突變型岭接。

基因突變：基因組DNA發(fā)生突然變化的富拗，可以遺傳的，變異現(xiàn)象鸣戴。從分子水平來(lái)看啃沪，就是發(fā)生在堿基序列上的變化。

堿基替換：在DNA分子中窄锅，一個(gè)堿基被另一個(gè)堿基替換的現(xiàn)象创千。

移碼突變：在正常的DNA分子中，堿基改變非3的倍數(shù)，導(dǎo)致在這個(gè)位置后面的所有堿基序列發(fā)生改變追驴，導(dǎo)致堿基編碼移位錯(cuò)誤的現(xiàn)象就做移碼突變械哟。

易位突變：染色體片段發(fā)生位置改變叫做易位，其中在同一條染色體上的改變叫做移位或者染色體內(nèi)易位殿雪，在不同染色體之間發(fā)生叫做染色體間易位暇咆。

染色體畸變：染色體畸變包括染色體數(shù)目的畸變和染色體形態(tài)的畸變。

同義突變：又叫沉默突變丙曙，是指DNA中的堿基改變導(dǎo)致mRNA的密碼子發(fā)生改變爸业，但是由于密碼子并沒(méi)有發(fā)揮作用，氨基酸并沒(méi)有發(fā)生改變的突變亏镰。

無(wú)義突變：DNA的突變導(dǎo)致mRNA中的密碼子改變?yōu)榱硪环N終止密碼子沃呢。

錯(cuò)義突變：DNA中的堿基改變導(dǎo)致mRNA中的密碼子發(fā)生改變，編碼成另一種氨基酸的突變拆挥。

形態(tài)突變型：指肉眼可見(jiàn)的突變型薄霜，比如說(shuō)性狀、大小纸兔、顏色的突變型惰瓜。

2.育種前的準(zhǔn)備——誘導(dǎo)細(xì)胞的選擇

1）單倍體細(xì)胞

2）單核或者細(xì)胞核盡可能少。

3）誘變劑作用機(jī)理選擇細(xì)胞狀態(tài)

4）分離純化

注意1）愛(ài)固定條件下培養(yǎng)細(xì)胞汉矿，2）利用成分固定的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)崎坊，3）細(xì)胞充分分散，4）誘變之后表型延遲

3.育種的一般流程

1）選擇出發(fā)菌株

2）出發(fā)菌株純化

3）制備單孢子

4）誘變劑或者誘變方式的選擇性

5）誘變條件的優(yōu)化

4.菌種篩選

1）篩選流程的確認(rèn)

2）篩選方法的確定和優(yōu)化

3）篩選培養(yǎng)基

4）產(chǎn)物測(cè)定

5）突變菌株的分純

6）突變菌株的工業(yè)化

5.育種的常見(jiàn)方法及原理

1）自然選育：小概率突變

2）經(jīng)典誘變：物理誘變洲拇、化學(xué)誘變（烷化劑奈揍、核酸堿基類似物、抗生素）赋续、復(fù)合誘變

產(chǎn)TG酶的菌種紫外誘變（制備孢子處理液男翰、紫外處理、涂布暗箱培養(yǎng)纽乱、高通量初篩蛾绎、搖瓶復(fù)篩、工業(yè)發(fā)酵罐放大）

亞硝基胍誘變：原理：烷化劑鸦列，是DNA上的堿基和磷酸部分被烷化租冠，DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致配對(duì)錯(cuò)誤而引起突變。誘變條件：不同pH的誘變機(jī)理不同薯嗤。

常溫常壓等離子體（ARTPA）常溫常壓等離子體突變顽爹，在其中含有多種化學(xué)活性成分粒子。

3）基于PCR技術(shù)的突變

隨機(jī)突變骆姐、定點(diǎn)突變镜粤、易錯(cuò)PCR捏题、基因重排、定向進(jìn)化（建庫(kù)）繁仁。

易錯(cuò)PCR：在采用DNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)涉馅，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件归园，比如說(shuō)加入鎂離子黄虱、加入錳離子、改變體系中的dNTP庸诱、低保真的酶等捻浦，來(lái)改變基因頻率，以此達(dá)到基因突變的效果桥爽。

基因重排：將含有不同大小的基因庫(kù)切成DNA小片段朱灿，小片段之間互為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增含有多個(gè)突變位點(diǎn)的基因钠四，轉(zhuǎn)化篩選盗扒。

定向進(jìn)化：突變文庫(kù)構(gòu)建（基于易錯(cuò)PCR以及基因文庫(kù)的建立），定向篩選（按照定向有目的篩選）缀去，基因鑒定（擴(kuò)增目標(biāo)基因侣灶，進(jìn)行鑒定）

PCR對(duì)基因的改造缺點(diǎn)：只能對(duì)單基因進(jìn)行改造，一般的酶分子不要過(guò)大缕碎，只能針對(duì)酶本身進(jìn)行改造褥影，往往適應(yīng)性不好，效果有限咏雌。

4）有性選育：雜交育種凡怎、原生質(zhì)體融合、基因組重排赊抖。

雜交育種：是將父母本雜交之后得到子代统倒，對(duì)子代進(jìn)行選育。

原生質(zhì)體融合：采用人工的方法氛雪，將兩個(gè)有一定性狀的原生質(zhì)體進(jìn)行融合從而達(dá)到育種目的檐薯。

基因組重排：基因組重排需要一個(gè)基因庫(kù)，然后通過(guò)原生質(zhì)體融合的方式將目的基因進(jìn)行隨即重排注暗。

第六章 酶的分離純化

1.分離純化的概要

1）酶蛋白純化的一般過(guò)程：合適的方法選取坛缕、蛋白質(zhì)來(lái)源及釋放、初步分離捆昏、純化赚楚、脫鹽濃縮、檢測(cè)保存

2）純化常規(guī)需要考慮

量：科研級(jí)別（微克）骗卜；醫(yī)藥上和工業(yè)上（公斤級(jí)）宠页，

純度：臨床治療99.9%左胞，食品級(jí)安全

原料來(lái)源：方便，低成本

破碎條件：溫和举户，去除雜志烤宙、脂質(zhì)、核酸俭嘁、毒素等物質(zhì)境蜕。

純化條件：緩沖體系轧粟，蛋白酶彬犯，穩(wěn)定性

2.蛋白質(zhì)的初步純化——分離

1）細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法婿着、化學(xué)破碎法、物理破碎法（壓力差近她、溫度差叉瘩、超聲）、酶促破碎法粘捎。

2）提绒泵濉：

?????? 鹽溶液提取：麩曲中的淀粉酶攒磨、蛋白酶等胞外酶泳桦。

?????? 酶溶液提取：胰蛋白酶的提取

?????? 堿溶液提冗志馈：細(xì)菌L—天冬酰胺酶

?????? 有機(jī)溶劑萃扰钛鳌：有機(jī)相、水相漆羔，多用于與脂質(zhì)可以牢固結(jié)合或者有較多極性基團(tuán)的酶提取梧奢。

3）沉淀分離：

???? 鹽析：利用不同蛋白質(zhì)在不同溶液當(dāng)中的溶解度不同進(jìn)行分離，通過(guò)在酶溶液中加入一定濃度的鹽使酶或者雜質(zhì)析出沉淀演痒，從而達(dá)到沉淀分離的作用亲轨。

?????? 等點(diǎn)點(diǎn)沉淀：利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)的溶解度最低，以及不同的良性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這個(gè)特征鸟顺，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH惦蚊，是沒(méi)或者雜質(zhì)析出。

?????? 有機(jī)溶劑沉淀法：利用酶或者其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同讯嫂，通過(guò)添加一定量的有機(jī)溶劑蹦锋，是沒(méi)或者雜志析出。

?????? 復(fù)合沉淀：在酶中加入某種物質(zhì)欧芽，使之與酶形成復(fù)合物莉掂，而沉淀下來(lái)。

?????? 選擇性變性沉淀：選擇一定條件使酶液中存在雜質(zhì)千扔，并且不會(huì)影響酶的作用效果憎妙。

4）離心分離

?????? 差速離心：根據(jù)粒子大小库正、沉降系數(shù)等進(jìn)行離心。

?????? 密度梯度離心：在密度梯度離心介質(zhì)（蔗糖厘唾、甘油）進(jìn)行離心褥符。

?????? 等密梯度離心：將介質(zhì)與樣品混合，由于各自的浮力上浮或者下沉抚垃。

5）膜分離：粗濾喷楣、微濾、超濾

3.蛋白質(zhì)的精細(xì)純化

1）色譜層析：吸附層析和分配層析（紙上層析和簿層層析）

2）不同層析的原理

3）分子排阻

4）離子交換層析

5）層析聚焦

6）疏水層析

4.高效液相色譜法

第七章 酶的性質(zhì)

1.酶的基本性質(zhì)

1）檢測(cè)

SED-PAGE

WB：是否為特異性蛋白

LC-MS/GC-MS：含量以及分子量

CD：研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

紫外掃描/分光光度法：濃度

DSC：通過(guò)吸放熱的特殊點(diǎn)發(fā)生蛋白質(zhì)溶解點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)分子連接點(diǎn)的研究讯柔。

晶體結(jié)構(gòu)：冷凍電鏡

2）酶的基本性質(zhì)

酶活：是指在一定條件下酶催化反應(yīng)的能力

酶活力大新胀堋：一定條件下酶催化反應(yīng)的速率

酶單位：一定條件下一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量护昧。

酶轉(zhuǎn)換數(shù)（Kcat）：一定條件下每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)來(lái)表示酶的反應(yīng)速率魂迄。

抑制劑：分子直接作用于酶，導(dǎo)致其催化效率較低的物質(zhì)叫做酶抑制劑惋耙。

3）酶學(xué)特征檢測(cè)

2.酶的穩(wěn)定性

金屬離子捣炬、底物、輔因子绽榛、其他相對(duì)低分子的分子質(zhì)量陪提的結(jié)合作用湿酸。

鹽橋、二硫鍵灭美、氫鍵推溃、

3.酶的變性機(jī)制

1）化學(xué)變性因素：

?????? 表面活性劑、去污劑：陰離子>陽(yáng)離子>無(wú)離子

?????? 變性劑：脲和鹽酸胍

?????? 高濃度鹽：硫酸銨届腐、酶穩(wěn)定劑

?????? 氰化鈉（紊亂劑）

?????? 有機(jī)溶劑

?????? 螯合

?????? 重金屬離子和巰基試劑

2）物理變性因素：熱铁坎、機(jī)械力、冷凍脫水犁苏、輻射作用

3）蛋白復(fù)性：不在完全不可逆失活的條件下硬萍，大多數(shù)蛋白質(zhì)可以復(fù)性。也就是重新具有酶的功能围详。

4）不可逆失活：

???? 蛋白質(zhì)水解酶和自溶作用：微生物或者外源蛋白水解酶的作用朴乖。

?????? 聚合作用：熱變性、二硫鍵重組

?????? 極端pH：?jiǎn)?dòng)改變助赞、交聯(lián)破壞氨基酸殘基

?????? 氧化作用：芳香族的側(cè)鏈氨基酸买羞、蛋氨酸、半胱氨酸雹食，胱氨酸殘基

4.酶的保存：保存條件狀態(tài)畜普、溫度、水分婉徘、氧氣漠嵌、保護(hù)劑咐汞。固定化、酶分子修飾

第八章 酶的保存

1.酶抑制劑

1）抑制劑：直接作用于酶使其翠花效率降低的分子儒鹿。

2）酶抑制劑的應(yīng)用：治療或者有毒

抑制作用類型：分為可逆抑制和不可逆抑制化撕，可逆抑制又可以分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制约炎。

可逆抑制：可逆抑制是說(shuō)對(duì)反應(yīng)的一直是可逆的植阴，以酶促反應(yīng)來(lái)說(shuō)，可逆性抑制劑與酶形成復(fù)合物圾浅，抑制酶與底物的作用掠手。但是在相同條件下，復(fù)合物又可以分解成酶和抑制劑狸捕，分解后的酶仍然可以催化反應(yīng)的發(fā)生喷鸽。

?????? 競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑與底物共同競(jìng)爭(zhēng)美的同一個(gè)活性位點(diǎn)，從而干擾了底物與酶的結(jié)合灸拍。

?????? 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑可與酶的其他活性部位結(jié)合做祝，但不會(huì)和底物競(jìng)爭(zhēng)同一個(gè)活性部位。

?????? 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑不能與游離酶發(fā)生結(jié)合鸡岗，但是可以與底物—酶的復(fù)合物發(fā)生結(jié)合混槐，從而抑制酶促反應(yīng)。

不可逆抑制：共價(jià)修飾改變酶的結(jié)果轩性，不可逆轉(zhuǎn)声登。大豆胰蛋白酶抑制劑只不可逆作用于多肽，青霉素亞砜只不可逆作用于內(nèi)酰胺酶揣苏。

3）酶抑制劑的應(yīng)用

神經(jīng)毒氣??乙酰膽堿酯酶

達(dá)菲競(jìng)爭(zhēng)性抑制流感

第九章 動(dòng)植物及其細(xì)胞產(chǎn)酶

1.動(dòng)物細(xì)胞及動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)酶

1）概述

?????? 動(dòng)物組織中有些酶的含量很高悯嗓，可以直接提取，利用動(dòng)物細(xì)胞額方法也可以產(chǎn)生大量的酶

2）動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)酶的特點(diǎn)：易獲取舒岸、動(dòng)物來(lái)源绅作、病毒、含量蛾派、純度不高俄认、可持續(xù)性不長(zhǎng)。

3）動(dòng)物產(chǎn)酶舉例

?????? 蝸牛酶的提群檎А：蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中植被的混合酶眯杏，含有纖維須眉，果膠酶壳澳，淀粉酶岂贩，蛋白酶等多種酶。

?????? 破殼巷波，摘嗦囊萎津，2-3倍緩沖液卸伞，過(guò)濾取濾液，凍干極為成品锉屈。

?????? 胰蛋白酶提取和精細(xì)純化荤傲。

?????? 豚鼠肝臟中 TG酶

4）動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)酶特點(diǎn)：

用于功能蛋白的生產(chǎn)

生產(chǎn)緩慢

需要添加抗生素

對(duì)剪切力面干、培養(yǎng)條件苛刻

有些只能貼壁培養(yǎng)颈渊。

培養(yǎng)基復(fù)雜遂黍，需要血清或替代品，價(jià)格昂貴俊嗽。

5）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝

懸浮培養(yǎng)雾家、貼壁培養(yǎng)、固定化細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)基：氨基酸绍豁、維生素芯咧、無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖妹田、生長(zhǎng)因子唬党、激素

溫度：36.5

6）重組蛋白表達(dá)

構(gòu)建表達(dá)載體

選擇合適的宿主細(xì)胞

有話培養(yǎng)基

優(yōu)化純化工藝

2.植物細(xì)胞產(chǎn)酶

1）概述半貼壁單層細(xì)胞室溫可以生長(zhǎng)鹃共，表達(dá)的重組蛋白可溶鬼佣，折疊正確有翻譯后修飾，有生物活性霜浴，比較容易分離晶衷，易于表達(dá)異源蛋白，安全

2）產(chǎn)酶方式

植物組織直接提取

愈傷組織培養(yǎng)

轉(zhuǎn)基因植物

植物細(xì)胞培養(yǎng)

原生質(zhì)體培養(yǎng)

3）植物細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞體積大阴孟，營(yíng)養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單晌纫，產(chǎn)率提高，所短周期永丝，易于管理锹漱、需要的條件較多（外界條件，修剪等）

4）植物組織培養(yǎng)

選擇和處理外植體慕嚷，分離細(xì)胞哥牍，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)喝检、原生質(zhì)體再生培養(yǎng)

5）示例：蒜素和蒜酶超氧化物歧化酶嗅辣、木瓜蛋白酶（提取煉乳，凝固挠说，陳江澡谭，干燥、麥芽糖酶损俭。