Tracking cell-type-specific temporal dynamics in human and mouse brains
關(guān)鍵詞： Neuron, TrackSci,scRNA-seq, scATAC-seq
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867423009765#fig3
一句話簡介：通過開發(fā)名為TrackSci 的新技術(shù)人芽，實現(xiàn)對人和小鼠大腦新生細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性的表征。
圖形摘要:
背景：
（1） 成年哺乳動物大腦中會不斷生成新的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，這是與記憶漫萄，學(xué)習(xí)，壓力相關(guān)的關(guān)鍵過程泄朴。目前普遍認(rèn)為宵凌，神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的生成會隨著年齡的增長逐漸減少，但是下降到何種程度仍存在爭議甸陌；
（2）此前，通過Div-seq(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5480621/)盐股，一種基于Edu標(biāo)記和 FACs的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)钱豁，已經(jīng)描繪了成人大腦中祖細(xì)胞的基因表達(dá)特征，但是對其表觀遺傳狀態(tài)及其在衰老過程中的變化仍不清楚疯汁；因此牲尺，定量捕獲新生細(xì)胞并追蹤其轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)狀態(tài)變化的新方法對于了解發(fā)育，衰老幌蚊，疾病狀態(tài)下的細(xì)胞群動態(tài)至關(guān)重要谤碳；
Single-cell combinatorial indexing VS 10x genomics single-cell sequencing
Single-cell combinatorial indexing: 通過組合索引組成細(xì)胞獨(dú)特的barcode
10x genomics: 基于油包水技術(shù)每個細(xì)胞與獨(dú)特的barcode反應(yīng)
正文：
1. 基于TrackSci 獲取的哺乳動物大腦新生細(xì)胞的全局概覽
為了同時捕獲大腦新生細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)狀態(tài)變化，作者首先開發(fā)了一種名為TrackSci的新技術(shù)溢豆。這些技術(shù)受到了Div-seq的技術(shù)啟發(fā)蜒简。其主要的工作流程包括(Fig 1A)：
（1）用Edu標(biāo)記小鼠；
（2）提取腦核漩仙，固定搓茬，然后通過點擊化學(xué)原位連接含疊氮化物的熒光基團(tuán)犹赖，然后進(jìn)行FACS 以富集Edu+ cells;
（3）通過兩輪索引，進(jìn)一步分選Edu+ cells
（4） single-cell combinatorial index RNA & ATAC sequencing
Figure 1.
利用這項技術(shù)卷仑，作者對Young, Adult, Age, 5xFAD 小鼠進(jìn)行了 sciATAC & RNA seq , 分別捕獲到了 14095 (RNA) 和 9316 (ATAC) 個細(xì)胞冷尉。然后對這些細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了 Louvain 聚類和UMAP可視化(Fig 1B)∠登梗基于已有的細(xì)胞marker (Fig C)雀哨，在RNA水平鑒定了 16個clusters, ATAC水平鑒定了 14個 clusters，其中有兩類細(xì)胞（室管膜細(xì)胞和脈絡(luò)從上皮細(xì)胞）可能因為豐度較低私爷，僅在RNA數(shù)據(jù)集中檢測到雾棺。總體上衬浑，從兩個分子層面定義的細(xì)胞類型重疊得很好捌浩，并且詳細(xì)展示出了少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)生軌跡。
接著工秩，作者觀察到了Edu+ cells 與 全腦細(xì)胞在細(xì)胞類型組成比例上的顯著差異尸饺。在全腦細(xì)胞中，成熟的神經(jīng)元細(xì)胞（如小腦顆粒細(xì)胞）和分化的膠質(zhì)細(xì)胞占主導(dǎo)地位助币，而前體細(xì)胞則很少浪听。然而在Edu+ cells中，則富集到了大量的前體細(xì)胞眉菱，如少突膠質(zhì)細(xì)胞OPCs, 嗅球神經(jīng)母細(xì)胞等等迹栓。并且，他們還發(fā)現(xiàn)通過TrackSci流程進(jìn)行的RNA/ATAC seq 在檢測細(xì)胞比例變化上有著非常高的一致性俭缓。
然后克伊，他們又將Edu + /Edu- cells細(xì)胞與小鼠全腦細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜進(jìn)行了整合，發(fā)現(xiàn)Edu+ cells 形成橋接幾種分化成熟細(xì)胞的連續(xù)細(xì)胞分化軌跡华坦，包括從少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）到成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化軌跡愿吹，以及從嗅球神經(jīng)母細(xì)胞到嗅球神經(jīng)元的分化軌跡等，但是這些“橋” 細(xì)胞在原先的圖譜分析中是沒有被發(fā)現(xiàn)的（Fig S1R）惜姐。
2. 鑒定新生細(xì)胞細(xì)胞類型特異性的表觀狀態(tài)和TF 調(diào)節(jié)因子
接下來犁跪，作者就對新生細(xì)胞進(jìn)行了差異表達(dá)和差異可及性分析，產(chǎn)生了5610個差異基因和 68556個差異可及性位點载弄。其中 1744（31%）的DE genes 在相同的細(xì)胞類型中具有對應(yīng)的差異可及性promoter耘拇。這些細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)和對應(yīng)啟動子的染色質(zhì)可及性展現(xiàn)出了良好的相關(guān)性（Fig 3A）撵颊。他們也檢測到了許多尚未被全面表征宇攻，但是細(xì)胞類型特異性很高的marker genes. 例如 Sox2 和Dcx (Fig S2B)。
然后倡勇，為了進(jìn)一步探究塑造新生細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的表觀狀態(tài)逞刷，作者鑒定了cell marker genes 細(xì)胞類型特異性表達(dá)背后的順式調(diào)控元件嘉涌。他們計算了88 個 pseudo-cells （按 k 均值聚類分組, 具有相鄰綜合 UMAP 坐標(biāo)的細(xì)胞子集 -- 類似于 meta-cell） 之間基因表達(dá)和鄰近位點可及性之間的相關(guān)性。在FDR=0.05的標(biāo)準(zhǔn)下夸浅，鑒定了 15485個基因和遠(yuǎn)端位點以及2832個基因和啟動子之間的正連接(Fig 3B)仑最。根據(jù)計算結(jié)果，大多數(shù)基因只與少數(shù)遠(yuǎn)端元件之間存在連接帆喇，中位數(shù)是每個基因和2個遠(yuǎn)端元件之間存在連接警医，例如Dlx2 基因。也有少數(shù)基因和多個遠(yuǎn)端位點之間存在連接坯钦，如 Olig2 基因（Fig 3C）预皇。其中 Dlx2的基因表達(dá)，啟動子可及性婉刀，連接的遠(yuǎn)端位點可及性都是在富集在神經(jīng)元發(fā)生軌跡中吟温，Olig2 基因都是富集在少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生軌跡中。
接著突颊，作者又計算了轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和motif可及性之間的相關(guān)性鲁豪，然后鑒定了70 個細(xì)胞類型特異性的TF調(diào)節(jié)因子，包括19 個潛在的抑制因子和 51個潛在的激活因子(Fig 3D)律秃。像Dlx2 的表達(dá)與motif的可及性呈正相關(guān)爬橡，而Olig2 的表達(dá)與motif可及性呈負(fù)相關(guān)（Fig 3F）。通過這種方法棒动，作者發(fā)現(xiàn)了許多之間研究相對較少的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子堤尾，如Zfx, Pou6f1, Hmbox1等。
3. 成年階段細(xì)胞類型特異性增殖速率的全球視角
在表征了新生細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和表觀狀態(tài)之后迁客，作者開始比較不同條件下細(xì)胞的增殖變化情況郭宝。通過比較年輕，成年掷漱，衰老和AD小鼠大腦中Edu+ cells的比例變化粘室，他們發(fā)現(xiàn)大腦細(xì)胞的增殖隨著年齡的增長而急劇下降(Fig 4A)。接著卜范，他們從細(xì)胞類型層面量化了不同細(xì)胞類型增殖率在不同時期的變化倍數(shù)衔统，檢測到了各位祖細(xì)胞對衰老的高度異質(zhì)性反應(yīng)。例如在衰老小鼠中海雪，齒狀回神經(jīng)母細(xì)胞的比例只有成年小鼠的1/18（Fig 4C）锦爵， 而血管細(xì)胞增殖僅受到輕微的影響。此外奥裸，小膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞可能由于衰老大腦中炎癥反應(yīng)的增加险掀，它們的細(xì)胞增殖能力有所上升，在整體的細(xì)胞組成比例中也大幅增加 (Fig 4C,D)湾宙。
為了進(jìn)一步驗證大腦衰老過程中細(xì)胞類型特異性的動態(tài)樟氢，作者將TrackSci 收集的細(xì)胞與 小鼠全腦細(xì)胞圖譜進(jìn)行了整合和比較分析冈绊，整合分析促進(jìn)了稀有祖細(xì)胞的鑒定，例如神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）埠啃，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（COP）死宣。 這兩類細(xì)胞在跨數(shù)據(jù)集中都展現(xiàn)出了隨著衰老，細(xì)胞比例顯著下降的趨勢碴开。而小膠質(zhì)細(xì)胞在衰老小鼠表現(xiàn)出增殖增加毅该。
此外，作者研究了衰老對祖細(xì)胞自我更新和分化潛能的影響潦牛，所謂的自我更新能力是新生成前體細(xì)胞與總前體細(xì)胞的比例鹃骂，分化潛能是新產(chǎn)生的分化成熟的細(xì)胞和分化軌跡中所有新生成細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示罢绽，細(xì)胞的自我更新和分化潛能都隨著衰老顯著下降畏线。
4. 衰老對成年小鼠神經(jīng)發(fā)生的影響
接著，作者開始探究衰老對成年小鼠神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生的影響良价，并描繪潛在的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控程序寝殴。首先，他們通過RNA 速率分析確定了三條神經(jīng)元分化的主要路徑明垢，即分化為齒狀回母細(xì)胞蚣常，星型膠質(zhì)細(xì)胞和嗅球神經(jīng)母細(xì)胞的三條途徑（Fig 5A）。他們收集了標(biāo)記1痊银，3抵蚊，9day的樣本進(jìn)行了TrackSci分析，觀察到隨著時間的延長溯革，更多分化成熟的細(xì)胞逐漸累積(Fig 5B)贞绳。通過差異表達(dá)分析，他們鑒定了隨著齒狀回和嗅球發(fā)育軌跡差異表達(dá)的基因致稀。此外冈闭，他們也鑒定了在發(fā)育過程發(fā)生動態(tài)變化的可及性位點，并從中鑒定出了與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子抖单，20 TFs 與DG neurongenesis 相關(guān)萎攒， 283 TFs與 OB neurongenesis相關(guān)。這些轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)與motif（結(jié)合基序）的染色質(zhì)可及性呈現(xiàn)出了很高的相關(guān)性（Fig 5C）矛绘。包括一些正調(diào)節(jié)因子如 Neurod1,Neurod2 耍休，以及抑制因子如Myt1l。
為了探究衰老對成年小鼠神經(jīng)發(fā)生的影響货矮，他們比較了在不同條件下羊精，通過trackSci 轉(zhuǎn)錄組測序捕獲到的，沿著神經(jīng)發(fā)生軌跡的細(xì)胞密度次屠。與先前細(xì)胞水平的分析相一致（Fig 4C）园匹，他們觀察到了隨著衰老雳刺，DGNB, NPC細(xì)胞密度的顯著下降（Fig 5D）劫灶。 接著裸违，他們使用milo 算法進(jìn)行差異豐度比較分析，來鑒定隨著衰老而顯著改變的細(xì)胞鄰域本昏。然后供汛，他們發(fā)現(xiàn)14個細(xì)胞鄰域表現(xiàn)出了顯著的下降，且主要來源于NPC涌穆，由此可見怔昨，衰老主要是通過下調(diào)祖細(xì)胞的增殖率來影響神經(jīng)發(fā)生（Fig 5E）。
為了進(jìn)一步探究NPC年齡依賴性變化的分子機(jī)制宿稀，作者又對年輕趁舀，成年和衰老小鼠的NPC細(xì)胞進(jìn)行了差異表達(dá)分析，鑒定了30個隨著時間推移顯示出一致變化的基因祝沸，這些基因的表達(dá)和啟動子的染色質(zhì)可及性變化也是相符合的（Fig 5F）矮烹，例如Nrg1 , Nrg3 兩個神經(jīng)營養(yǎng)因子，有報道稱體內(nèi)給予這兩個因子可以促進(jìn)神經(jīng)元生成罩锐。
另外奉狈，作者也通過分析已經(jīng)發(fā)表的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了驗證。該數(shù)據(jù)集采用了一種全基因組CRISPR 掃描的方法涩惑，可以通過定量基因特異性的sgRNA來系統(tǒng)評估基因在神經(jīng)發(fā)生過程中的作用（Fig 5G) ^1仁期。
1 The logic is that if the knockout of a gene results in a disadvantage for cell activation and proliferation, there will be fewer cells with that gene knocked out, leading to a lower enrichment of the corresponding sgRNA. Conversely, if knocking out a gene gives an advantage to activation and proliferation, cells with that gene knocked out will be more abundant, resulting in higher enrichment of the corresponding sgRNA.
他們比較了在此次研究中鑒定的衰老下調(diào)基因與隨機(jī)挑選基因的sgRNA富集程度，發(fā)現(xiàn)這些衰老下調(diào)基因的富集程度顯著低于對照組竭恬，因此跛蛋，這一結(jié)果提示了這些基因的敲除會導(dǎo)致NPC的增殖受損。同樣痊硕，他們也比較了在2021年已發(fā)表研究中通過CRISPR篩選的敲除后最可能導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生損傷的基因在本次研究數(shù)據(jù)集中表達(dá)情況问芬，發(fā)現(xiàn)這些基因都是隨著衰老而表達(dá)下降（Fig 5H）。
5. 衰老對少突膠質(zhì)細(xì)胞生成的影響
接下來寿桨，作者又探究了衰老對少突膠質(zhì)細(xì)胞生成的影響此衅。他們挑選了少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行擬時序和軌跡推斷分析，產(chǎn)生了一條簡單的發(fā)育軌跡亭螟。并通過在Edu標(biāo)記后第1天挡鞍，第3天，第9天收樣測序和細(xì)胞密度分析预烙，驗證了推斷的發(fā)育軌跡墨微。
同樣的阎抒，他們又沿著發(fā)育軌跡進(jìn)行了差異表達(dá)和差異可及性分析缩滨，鑒定了8443個差異表達(dá)基因和15164個差異可及性位點坡氯。通過計算TF和motif可及性之間的相關(guān)性市袖，他們又從中挑選出了97個TF表達(dá)和motif可及性高度相關(guān)的組合。其中包括一些已知的少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生相關(guān)調(diào)節(jié)因子锈麸，如Sox5,也包括一些尚未表征的新轉(zhuǎn)錄因子和潛在的抑制子镀脂。
然后，他們分析了不同條件下忘伞，少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育軌跡上的細(xì)胞密度變化薄翅，并進(jìn)行了與之前類似的細(xì)胞豐度差異分析，發(fā)現(xiàn)衰老時主要是COP（定型少突膠質(zhì)前體細(xì)胞）數(shù)目下降氓奈，而早期的OPC（少突膠質(zhì)祖細(xì)胞）變化并不顯著（Fig 6D,6E）翘魄。這一觀察與作者的一項配套研究和先前的報告中發(fā)現(xiàn)的衰老時新形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞耗竭相一致。
接著舀奶，為了進(jìn)一步分析這一現(xiàn)象背后的分子機(jī)制暑竟，他們鑒定了隨著衰老OPC中表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因。其中大部分的DE基因都得到基因表達(dá)水平和啟動子可及性的雙重驗證育勺。這些基因在功能上與細(xì)胞遷移但荤，Ca2+通道，鞘磷脂代謝怀大，還有細(xì)胞循環(huán)相關(guān)纱兑。
6. TrackSci 有助于識別老年人類大腦中的稀有祖細(xì)胞
接下來，作者試圖研究TrackSci 數(shù)據(jù)集能否促進(jìn)老年人類大腦中稀有祖細(xì)胞類型的鑒定化借。他們首先對 6個個體共29個老年人腦樣本進(jìn)行了單核RNA-seq潜慎，總共獲得了798434個細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)。由于衰老人腦中增殖細(xì)胞的稀有性蓖康，直接從原始的圖譜中通過無監(jiān)督聚類來鑒定循環(huán)細(xì)胞和分化細(xì)胞是非常困難的（Fig S7C）铐炫。
因此，作者將本研究中獲得的小鼠 TrackSci 數(shù)據(jù)與人類大腦數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合蒜焊，盡管存在跨物種的差異倒信，整合的數(shù)據(jù)還是幫助鑒定了老年人類大腦中的罕見增殖細(xì)胞群。例如泳梆，他們鑒定了一群在人類與小鼠Edu+ cells重疊的循環(huán)細(xì)胞（Fig 7A）鳖悠，進(jìn)一步的亞聚類分析又將這群細(xì)胞分成了 循環(huán)膠質(zhì)細(xì)胞，Cycle OPC优妙，Erythroblasts-Cycle （循環(huán)紅細(xì)胞）乘综，這些細(xì)胞當(dāng)中也表達(dá)典型的細(xì)胞周期相關(guān)基因（Fig 7B,7C）。
此外套硼，整合分析還促進(jìn)了典型細(xì)胞分化軌跡的鑒定卡辰。例如，在人類大腦數(shù)據(jù)中也鑒定到了連接OPC和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的COP。為了進(jìn)一步探究少突膠質(zhì)細(xì)胞生成過程中物種間保守的調(diào)控程序九妈，他們整合小鼠和人類的數(shù)據(jù)反砌，構(gòu)建了一條平滑的細(xì)胞分化軌跡（Fig 7D）。并沿著分化軌跡萌朱，鑒定了人類中5680 個顯著改變的基因宴树，其中1162個基因在小鼠和人類當(dāng)中是共享。其中包括一些其中報道了參與少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子嚷兔，如TCF7L1,TCF7L2森渐。同時做入，他們也鑒定了物種間特異的調(diào)控基因冒晰，發(fā)現(xiàn)人類特異性的基因在功能與核糖體發(fā)生相關(guān)，小鼠特異性的基因主要和miRNA的處理和 mRNA 3' end的處理相關(guān)(Fig 7E,7F)竟块。
此外壶运，他們也探究了少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生在不同腦區(qū)之間的差異，發(fā)現(xiàn)所有小腦樣本中的COP都是有所減少的(Fig 7G)浪秘。為了探索更深入的分子機(jī)制蒋情，他們進(jìn)行了跨腦區(qū)的差異表達(dá)分析，分別鑒定了OPC, COP和OLG（少突膠質(zhì)細(xì)胞）的區(qū)域差異基因耸携，發(fā)現(xiàn) 45個OPC region specific genes中有 40 個是在小腦當(dāng)中高度富集的棵癣。由此可見，小腦當(dāng)中的OPCs 可能與其他區(qū)域的OPCs有著不一樣的分子狀態(tài)(Fig 7F,7H)夺衍。
Discussion
- 開發(fā)了一種能夠表征體內(nèi)前體細(xì)胞的異質(zhì)性和動態(tài)的新型測序方法 – TrackSci ;
- 基于TrackSci 表征了小鼠不同年齡階段的大腦前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)狀態(tài)狈谊；
- 揭示了衰老相關(guān)的細(xì)胞類型特異性增殖和分化能力的改變；
- 展示了TrackSci 數(shù)據(jù)集作為跨物種罕見增殖或分化細(xì)胞鑒定的錨的能力沟沙。
