文章信息：
文章題目：Integrated single-cell profiling dissects cell-state-specific enhancer landscapes of human tumor-infiltrating T cells
期刊：bioRxiv
鏈接：https://doi.org/10.1101/2022.03.16.484513
摘要：
耗竭性T細(xì)胞在腫瘤組織中普遍存在研底，并且存在一定的異質(zhì)性轻要。盡管人們對(duì)耗竭性T細(xì)胞的染色質(zhì)可及性特征進(jìn)行了廣泛研究摊滔，但腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞（TILs）的異質(zhì)性和功能障礙的潛在轉(zhuǎn)錄重塑機(jī)制仍不太清楚。在本研究中，我們利用單細(xì)胞ATAC-seq技術(shù)從四種原位瘤的TILs細(xì)胞中鑒定了不同功能狀態(tài)的CD8+ 細(xì)胞的組織特異性和共有的基因調(diào)控元件。通過(guò)單細(xì)胞ATAC-seq和RNA-seq多組學(xué)整合分析獲得了腫瘤TILs細(xì)胞的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作圖譜，并鑒定了細(xì)胞狀態(tài)特異性的超級(jí)增強(qiáng)子調(diào)控元件救恨。同時(shí)，基于單細(xì)胞染色質(zhì)可及性擬時(shí)序分化軌跡推斷分析岂却，我們鑒定了耗竭性T細(xì)胞在功能障礙的分化過(guò)程中的關(guān)鍵增強(qiáng)子元件忿薇、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和靶基因。最后躏哩，我們通過(guò)CRISPRi/a干擾技術(shù)驗(yàn)證了T細(xì)胞耗竭關(guān)鍵基因的增強(qiáng)子調(diào)控元件缰趋【氩祝總之窿撬，我們的研究為理解和操縱人類(lèi)腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞不同細(xì)胞狀態(tài)特異性基因的調(diào)控元件提供了理論基礎(chǔ)和分析框架零远。
關(guān)鍵詞：
T cell exhaustion, chromatin, gene regulation, CRISPR activation, CRISPR interference, enhancer, single-cell multi-omics, cancer immunity
背景：
功能障礙T細(xì)胞，也叫耗竭性T細(xì)胞（Tex）正驻，其清除病原體和惡性腫瘤細(xì)胞的能力受限弊攘。最近的研究集中關(guān)注在T細(xì)胞功能障礙的機(jī)制上抢腐，已有的研究表明T細(xì)胞在功能失調(diào)過(guò)程中的染色質(zhì)景觀發(fā)生了進(jìn)行性和部分不可逆的重編程，并伴隨著效應(yīng)功能受損襟交、增殖和存活能力減弱[1]迈倍。染色質(zhì)狀態(tài)的改變將T細(xì)胞鎖定在其功能失調(diào)的狀態(tài)，因此捣域，通過(guò)檢查點(diǎn)阻斷來(lái)實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞長(zhǎng)期活力的恢復(fù)能力受限[2]啼染，并阻礙了嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞的過(guò)繼細(xì)胞療法[3]。重要的是焕梅，在最近的幾項(xiàng)研究中迹鹅，人們?cè)诤慕咝訲 細(xì)胞池中發(fā)現(xiàn)了一群具有較強(qiáng)自我更新能力的細(xì)胞，這群細(xì)胞可以對(duì)檢查點(diǎn)阻斷療法作出反應(yīng)贞言，并產(chǎn)生對(duì)病毒或腫瘤控制至關(guān)重要的終末分化細(xì)胞[4-9]斜棚。因此，深入探究人類(lèi) TILs細(xì)胞的異質(zhì)性和調(diào)控機(jī)制對(duì)于理解和改善細(xì)胞免疫療法的反應(yīng)至關(guān)重要该窗。
在分子水平上弟蚀，調(diào)節(jié)基因表達(dá)的耗竭特異性遠(yuǎn)端調(diào)控元件（如增強(qiáng)子）可以有效區(qū)分功能失調(diào)和功能性 T 細(xì)胞的狀態(tài)，這些增強(qiáng)子元件調(diào)控T 細(xì)胞功能障礙相關(guān)基因的表達(dá)挪捕，如免疫檢查點(diǎn)程序性細(xì)胞死亡 1 (PDCD1)[10]粗梭。單個(gè)增強(qiáng)子元件調(diào)控淋巴細(xì)胞的功能已得到了充分證實(shí)争便，但人們僅在全基因組范圍內(nèi)數(shù)十萬(wàn)個(gè)調(diào)控區(qū)域的一小部分有了一定的了解级零。一個(gè)典型的例子是Th2 細(xì)胞因子基因座的調(diào)控區(qū)域，它通過(guò)染色質(zhì)遠(yuǎn)程相互作用調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)依賴(lài)的IL-4滞乙、IL-5 和 IL-13 基因的特異性表達(dá)[11]奏纪。增強(qiáng)子對(duì) T 細(xì)胞狀態(tài)的信號(hào)依賴(lài)性功能調(diào)節(jié)作用進(jìn)一步體現(xiàn)在 IL2RA 基因（編碼 CD25，高親和力 IL-2 受體的一個(gè)亞基）上斩启，該基因中一個(gè)內(nèi)含子 DNA 元件的缺失導(dǎo)致了初始 T 細(xì)胞從誘導(dǎo)的 Treg 細(xì)胞極化為體內(nèi)促炎的Th17 細(xì)胞[12]序调。另一項(xiàng)研究表明，PDCD1基因上游增強(qiáng)子元件的缺失降低了抗原特異性CD8+ T 細(xì)胞中活化誘導(dǎo)的PD1的表達(dá)兔簇，從而增加了記憶 T 細(xì)胞的形成并改善了體內(nèi)腫瘤的控制[13]发绢。與人類(lèi)系統(tǒng)類(lèi)似，PDCD1基因遠(yuǎn)端增強(qiáng)子元件的缺失降低了CAR-T 細(xì)胞在慢性感染體外激活期間共抑制受體 PD1 的表達(dá)[14]垄琐，這表明增強(qiáng)子元件的編輯可以改善免疫治療的療效边酒。因此，研究細(xì)胞狀態(tài)特異性增強(qiáng)子元件的調(diào)控作用狸窘，對(duì)于理解免疫系統(tǒng)過(guò)程的分子機(jī)制（如 T 細(xì)胞功能狀態(tài)變化）至關(guān)重要墩朦。然而，目前人們對(duì)人類(lèi) TILs 細(xì)胞中增強(qiáng)子元件的調(diào)控作用機(jī)制受到了一定的限制翻擒。
首先氓涣，關(guān)于T細(xì)胞功能障礙的染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)主要來(lái)源于癌癥或慢性感染模型小鼠或健康人類(lèi)供體 T 細(xì)胞的批量分析[1,2,10,15-17]牛哺。盡管人們通過(guò)多種計(jì)算方法努力統(tǒng)一不同模型中的T 細(xì)胞染色質(zhì)數(shù)據(jù)，但慢性感染和癌癥模型之間的差異是大家公認(rèn)的[18]劳吠。與此一致引润，最近關(guān)于 CAR-T 細(xì)胞耗竭的研究揭示了小鼠和人類(lèi) T 細(xì)胞功能障礙特異性調(diào)節(jié)組之間的差異[14]，這是由于與蛋白編碼基因相比痒玩，增強(qiáng)子元件在不同物種之間的保守性較低[19]椰拒。到目前為止，只有少數(shù)的研究探究了單個(gè)癌癥實(shí)體中人類(lèi) TIL細(xì)胞的單細(xì)胞染色質(zhì)景觀[20]凰荚。因此燃观，目前仍缺乏對(duì)異質(zhì)性T 細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)及其在人類(lèi)不同癌癥中相關(guān)增強(qiáng)子景觀的全面和概括描述。其次便瑟，人們對(duì)遠(yuǎn)端非編碼調(diào)控元件的染色質(zhì)變化與其受調(diào)控靶基因之間的相互作用關(guān)系也不太了解缆毁。由于增強(qiáng)子可以發(fā)揮遠(yuǎn)距離作用，因此解析增強(qiáng)子-啟動(dòng)子的互作關(guān)系對(duì)于產(chǎn)生關(guān)于體內(nèi)關(guān)鍵基因調(diào)控的假設(shè)至關(guān)重要到涂。第三脊框，由于染色質(zhì)互作研究通常會(huì)產(chǎn)生數(shù)千個(gè)假定的細(xì)胞狀態(tài)特異性增強(qiáng)子元件，因此迫切需要對(duì)基因及其互作的增強(qiáng)子元件進(jìn)行優(yōu)先排序践啄，以解析不同功能性和功能失調(diào)T 細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控元件浇雹，從而改善CAR-T等細(xì)胞治療產(chǎn)品的療效。
在本研究中屿讽，我們?cè)噲D鑒定人類(lèi) TILs細(xì)胞中關(guān)鍵基因的增強(qiáng)子調(diào)控元件昭灵。我們通過(guò)對(duì)多個(gè)病人來(lái)源的四種癌癥實(shí)體進(jìn)行單細(xì)胞ATAC-seq和RNA-seq整合分析，預(yù)測(cè)了大量的功能性和功能障礙T細(xì)胞狀態(tài)的潛在增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作鏈接伐谈，并通過(guò)超級(jí)增強(qiáng)子分析從中篩選出關(guān)鍵調(diào)控元件烂完。最后，我們使用CRISPR干擾技術(shù)驗(yàn)證了編碼PD1和TCF1關(guān)鍵基因的增強(qiáng)子元件诵棵】衮迹總之，我們的研究表明履澳，盡管人類(lèi) TIL細(xì)胞發(fā)生了組織特異性重塑嘶窄，但在T細(xì)胞功能和功能失調(diào)狀態(tài)下存在統(tǒng)一的核心基因調(diào)控模式，這些模式可以通過(guò) CRISPR 激活/干預(yù)的增強(qiáng)子靶向來(lái)調(diào)節(jié)距贷。從某個(gè)角度來(lái)看柄冲，我們的研究提供了一個(gè)分析框架，在癌癥背景下人們可以通過(guò)編輯非編碼基因組來(lái)控制T 細(xì)胞的關(guān)鍵基因表達(dá)储耐。
測(cè)序信息：
本研究從三種原位瘤HCC, ccRCC和HNSCC的腫瘤樣本中分離TLIs細(xì)胞羊初，利用改進(jìn)優(yōu)化后的單細(xì)胞ATAC-seq測(cè)序技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析，并從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中下載配套的單細(xì)胞RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。同時(shí)长赞，還從已發(fā)表文章的公共數(shù)據(jù)中下載了BCC腫瘤樣本的單細(xì)胞ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)晦攒。
結(jié)果解讀：
1.構(gòu)建了人類(lèi)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性圖譜
為了探究人類(lèi)腫瘤浸潤(rùn)TILs細(xì)胞的染色質(zhì)可及性動(dòng)態(tài)變化特征，我們利用改進(jìn)優(yōu)化后的單細(xì)胞ATAC-seq技術(shù)進(jìn)行測(cè)序分析得哆。通過(guò)優(yōu)化細(xì)胞裂解緩沖液和建庫(kù)流程脯颜，我們可以得到信噪比更高、雙細(xì)胞比例更低的測(cè)序數(shù)據(jù)贩据《安伲基于優(yōu)化后的測(cè)序流程，我們從不同腫瘤樣本（頭頸鱗狀細(xì)胞癌HNSCC: 4 patients, 13 samples; 肝細(xì)胞癌HCC: 4 patients, 13 samples; 腎透明細(xì)胞癌ccRCC: 4 patients, 13 samples）中分離了CD8+PD1+和CD8+PD1-的TILs細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析饱亮。其中矾芙，在ccRCC和HCC腫瘤中還提取了癌旁正常組織的樣本，以及正常供體PBMC來(lái)源的CD8+T細(xì)胞（5 donors, 9 samples）作為對(duì)照近上。同時(shí)剔宪，我們還從已發(fā)表公共數(shù)據(jù)中獲得了基底細(xì)胞癌BCC（4 patients, 7 samples）的單細(xì)胞數(shù)據(jù)。經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控和過(guò)濾后壹无，得到了不同腫瘤TILs CD8+T細(xì)胞的高質(zhì)量染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)葱绒。
Figure 1: scATAC-seq workflow and flow cytometric analysis of patient samples
為了得到腫瘤TILs中不同功能狀態(tài)T細(xì)胞的染色質(zhì)可及性特征和轉(zhuǎn)錄調(diào)控圖譜，我們對(duì)不同腫瘤樣本的TILs細(xì)胞進(jìn)行了批次矯正和整合斗锭，進(jìn)一步降維聚類(lèi)分群得到了11種不同功能狀態(tài)的T細(xì)胞亞群地淀。基于基因活性得分對(duì)不同T細(xì)胞亞群進(jìn)行差異分析岖是，共得到了8,453個(gè)細(xì)胞類(lèi)群特異的差異表達(dá)基因帮毁，表明不同功能狀態(tài)的T細(xì)胞具有各自特異的染色質(zhì)可及性特征。如璧微，cluster7 MAIT細(xì)胞具有較高的ZBTB16基因活性作箍，cluste6 naive CD8+ T細(xì)胞具有較高的LEF1基因活性，cluster11 memory T細(xì)胞具有較高的IL7R基因活性前硫，cluster10 Tpex細(xì)胞具有較高的CXCR5和TCF7基因活性，cluster1-4 Dysfunctional T細(xì)胞具有較高的HAVCR2, ENTPD1和TOX基因活性荧止。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們細(xì)胞注釋的結(jié)果屹电，我們收集了不同T細(xì)胞狀態(tài)的基因集進(jìn)行基因集富集分析，結(jié)果表明我們注釋到的細(xì)胞類(lèi)群具有可靠性跃巡∥：牛總之，我們構(gòu)建了人類(lèi)腫瘤TILs中不同功能狀態(tài)T細(xì)胞的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性動(dòng)態(tài)變化圖譜素邪，揭示了TILs中不同T細(xì)胞功能狀態(tài)的染色質(zhì)異質(zhì)性特征外莲。
Figure 2: Single-cell ATAC-seq identifies chromatin states over a wide breadth of human primary CD8+T cell functional states
2. 鑒定了TILs中不同細(xì)胞狀態(tài)組織特異性和共有的基因調(diào)控元件
接下來(lái)，為了進(jìn)一步探究不同功能狀態(tài)T細(xì)胞亞群的基因調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。我們從11個(gè)T細(xì)胞亞群中共鑒定到了200,015個(gè)染色質(zhì)可及性peaks偷线，他們包含了基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等不同調(diào)控區(qū)域磨确，差異可及性分析共得到了568,94個(gè)細(xì)胞類(lèi)群特異性的peaks。對(duì)差異peaks進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子motif富集分析声邦，得到了不同細(xì)胞類(lèi)群特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子乏奥。如，在na?ve和in vitro activated的T細(xì)胞中富集到了TCF motif亥曹，在MAIT細(xì)胞特異性開(kāi)放的peaks中富集到了RORgt轉(zhuǎn)錄因子邓了，在dysfunctional T細(xì)胞中富集到了POU motif。同時(shí)媳瞪，我們還使用chromVAR軟件從單細(xì)胞水平計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞中特定轉(zhuǎn)錄因子motif的變異活性骗炉。其中，在top100 高變異的TF motif中鑒定到了影響不同T細(xì)胞亞群分化蛇受，激活和耗竭的特殊轉(zhuǎn)錄因子痕鳍，如AP-1，BATF龙巨，NFkB笼呆，RORgt，T-bet旨别，Nur77诗赌，TCF和NFAT等。UMAP可視化可以看到轉(zhuǎn)錄因子RORgt的motif活性在MAIT細(xì)胞中最強(qiáng)秸弛，TCF的motif活性在na?ve細(xì)胞中最強(qiáng)铭若，NFkB和Nur77轉(zhuǎn)錄因子的活性在Tex細(xì)胞的4個(gè)cluster中最強(qiáng)。
已有研究表明不同組織內(nèi)的免疫細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)具有不同的特征递览，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)功能障礙的3個(gè)T細(xì)胞亞群cluster1叼屠，2和4主要來(lái)源于不同腫瘤組織亞型（cluster1 BCC; cluster2 HCC; cluster4 ccRCC）。為了探究不同腫瘤組織中功能失調(diào)T細(xì)胞之間的染色質(zhì)可及性的組織特異性特征绞铃，我們對(duì)這三個(gè)cluster亞群進(jìn)行了差異分析镜雨，得到了6,332個(gè)腫瘤組織特異性的差異peaks。對(duì)這些差異peaks進(jìn)行TF motif富集分析儿捧，發(fā)現(xiàn)了不同腫瘤組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子荚坞，如在BCC-dominated的cluster中富集到bZIP，ETS菲盾，NR和POU轉(zhuǎn)錄因子颓影，在RCC和HCC-dominated的cluster中富集到T-box和RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子，在ccRCC-dominated的cluster中富集到NFkB轉(zhuǎn)錄因子懒鉴。
Figure 3: Differential state-specific gene-regulatory cues of human CD8+ T cells states
3. 揭示了腫瘤中耗竭性T細(xì)胞功能障礙的核心擬時(shí)序分化軌跡
耗竭性T細(xì)胞具有一定的異質(zhì)性诡挂，在往終末分化的功能失調(diào)過(guò)程中存在染色質(zhì)可及性的重塑。為了探究耗竭性T細(xì)胞在功能失調(diào)過(guò)程中染色質(zhì)可及性的動(dòng)態(tài)變化特征，我們對(duì)傳統(tǒng)的CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行了亞群重聚類(lèi)分析璃俗，共得到了6個(gè)T細(xì)胞亞群奴璃，分別為cluster1-Tex term，cluster2-Tex prolif旧找，cluster3-Tpex溺健，cluster4-Tmem，cluster5-Tact/heatshock钮蛛，cluster6-Tcytotoxic鞭缭。不同功能狀態(tài)T細(xì)胞亞群特征基因的基因活性得分和基因集富集得分的結(jié)果，都表明我們T細(xì)胞類(lèi)群注釋的準(zhǔn)確性魏颓。如Tpex細(xì)胞亞群中TCF7和CXCR5的基因活性得分較高岭辣，Tmem細(xì)胞亞群中IL7R, BACH2和LEF1的基因活性得分較高。接下來(lái)甸饱，我們基于Tpex-Tex term（cluster3-cluster2-cluster1）的分化路徑對(duì)耗竭性T細(xì)胞進(jìn)行了擬時(shí)序分析沦童，可以看到HAVCR2的基因活性在這個(gè)分化軌跡中逐漸增強(qiáng)，而TCF7的基因活性則逐漸減弱叹话。同時(shí)偷遗，我們還發(fā)現(xiàn)Tpex細(xì)胞在往終末分化的Tex細(xì)胞分化的過(guò)程中，染色質(zhì)的可及性驼壶、轉(zhuǎn)錄因子的TF motif活性和基因活性均處于連續(xù)的動(dòng)態(tài)變化中氏豌。
Figure 4: A unifying core pathway to terminal dysfunction of human CD8+ TILs
4. 單細(xì)胞表觀組和轉(zhuǎn)錄組整合分析鑒定TILs相關(guān)基因的潛在增強(qiáng)子調(diào)控元件
接下來(lái)，為了進(jìn)一步探究TILs細(xì)胞中特殊調(diào)控元件與其靶基因之間潛在的調(diào)控關(guān)系热凹，我們收集了相應(yīng)腫瘤TILs細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析泵喘。經(jīng)批次矯正和多樣本整合后，我們得到了38,356個(gè)CD8+ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜般妙。細(xì)胞降維聚類(lèi)分群后共得到了9個(gè)T細(xì)胞亞群纪铺，基于不同T細(xì)胞亞群特征基因的表達(dá)情況進(jìn)行了細(xì)胞功能注釋。如cluster1-cytotoxic T細(xì)胞亞群中高表達(dá)CX3CR1, FGFBP2, FCGR3A, TBX21等碟渺，cluster6-cycling T細(xì)胞高表達(dá)增殖基因MKI67鲜锚，cluster3-dysfunctional T細(xì)胞亞群高表達(dá)TOX, ENTPD1, HAVCR2, PDCD1和LAYN基因等，cluster0-Tpex細(xì)胞亞群高表達(dá)CXCR5, TCF7, CD27和GZMK等基因止状。接下來(lái)烹棉，我們對(duì)單細(xì)胞ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合分析，將scATAC-seq數(shù)據(jù)中的基因活性與scRNA-seq數(shù)據(jù)的基因表達(dá)進(jìn)行整合比對(duì)怯疤，可以看到兩種不同測(cè)序數(shù)據(jù)注釋到的T細(xì)胞亞群之間具有較高的一致性。同時(shí)催束，基于整合的數(shù)據(jù)我們計(jì)算了開(kāi)放性peaks和基因表達(dá)之間的相關(guān)性集峦，共得到了49,902個(gè)特定的peak-to-gene（PGLs）的互作關(guān)系。如EOMES，KLF3塔淤，GZMB和IL2RA等基因摘昌，可以看到他們的啟動(dòng)子和遠(yuǎn)處的增強(qiáng)子之間具有較強(qiáng)的共可及性互作關(guān)系，這些遠(yuǎn)程調(diào)控元件共同調(diào)控著這些基因的轉(zhuǎn)錄水平高蜂。為了驗(yàn)證這些預(yù)測(cè)出的promoter-enhancer互作關(guān)系的準(zhǔn)確性聪黎，我們利用已發(fā)表文章的promoter-capture HiC數(shù)據(jù)得到的基因互作關(guān)系對(duì)他們進(jìn)行富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些預(yù)測(cè)出的PGLs能夠很好的富集到HiC數(shù)據(jù)的互作loop中备恤。
Figure 5: Integrated single-cell RNA and chromatin accessibility profiling predict enhancer-gene interactions of human tumor infiltrating T cells
5. CRISPRi/a干擾技術(shù)驗(yàn)證不同狀態(tài)T細(xì)胞功能特異性基因的增強(qiáng)子元件
超級(jí)增強(qiáng)子在決定細(xì)胞類(lèi)型特異性基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用稿饰，他們通常是一連串增強(qiáng)子元件的集合，富集著較強(qiáng)的組蛋白H3K27ac乙趼恫矗化修飾信號(hào)喉镰。為了探究腫瘤TILs中不同T細(xì)胞亞群超級(jí)增強(qiáng)子的使用差異，我們利用預(yù)測(cè)出的PGLs關(guān)系對(duì)每個(gè)基因互作peaks的數(shù)目累加進(jìn)行排序惭笑，計(jì)算排序圖的拐點(diǎn)得到不同細(xì)胞亞群特異的超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)基因侣姆。如在terminal Tex細(xì)胞亞群中鑒定到了TOX, ENTPD1, HAVCR2和CTLA4等基因，在Tpex細(xì)胞亞群中鑒定到了TCF7和CXCR5超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)基因沉噩，在cytotoxic T細(xì)胞亞群中鑒定到了TBX21, CX3CR1, ZEB2, KLF2和FGFBP2等基因捺宗。這些超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)基因在不同T細(xì)胞亞群的功能和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，表明不同T細(xì)胞亞群有著各自特異的超級(jí)增強(qiáng)子調(diào)控元件川蒙。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們鑒定到的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作關(guān)系對(duì)關(guān)鍵功能基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制蚜厉，我們使用CRISPR 激活（CRISPRa）和干預(yù)（CRISPRi）技術(shù)對(duì)關(guān)鍵基因的遠(yuǎn)程調(diào)控增強(qiáng)子元件進(jìn)行激活和抑制，以探究這些增強(qiáng)子元件對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制派歌。我們使用CRISPRa技術(shù)激活PD1基因下游5kb出的一個(gè)增強(qiáng)子元件弯囊，流式分析結(jié)果表明激活該增強(qiáng)子元件后可以得到更多的PD1陽(yáng)性的T細(xì)胞。同樣的胶果，我們還使用CRISPRi技術(shù)干預(yù)了TCF7基因上游27kb出的一個(gè)增強(qiáng)子元件匾嘱，結(jié)果表明干預(yù)該增強(qiáng)子元件后TCF7陽(yáng)性的T細(xì)胞顯著減少≡缈伲總之霎烙，通過(guò)單細(xì)胞多組學(xué)整合分析，我們鑒定到了不同功能狀態(tài)T細(xì)胞亞群各自特異的關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件蕊连，并通過(guò)CRISPRi/a干擾技術(shù)驗(yàn)證了這些遠(yuǎn)程調(diào)控增強(qiáng)子元件對(duì)相應(yīng)靶基因的互作調(diào)控關(guān)系悬垃。
Figure 6: CRISPRi/a validation of cell-state-specific enhancers
總結(jié)：
本研究利用改進(jìn)優(yōu)化后的單細(xì)胞ATAC-seq測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了不同腫瘤TILs中T細(xì)胞的染色質(zhì)可及性圖譜，并解析了不同功能狀態(tài)T細(xì)胞亞群染色質(zhì)可及性的異質(zhì)性特征和耗竭性T細(xì)胞的組織特異性調(diào)控元件及其核心擬時(shí)序分化發(fā)育軌跡甘苍。通過(guò)單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析尝蠕，鑒定了不同細(xì)胞亞群特異的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作關(guān)系和關(guān)鍵調(diào)控靶基因，并利用CRISPRi/a干擾技術(shù)驗(yàn)證了這些遠(yuǎn)程調(diào)控增強(qiáng)子元件對(duì)相應(yīng)靶基因的互作調(diào)控關(guān)系载庭】幢耍總之廊佩，我們的結(jié)果為深入研究T細(xì)胞耗竭關(guān)鍵基因的非編碼調(diào)控元件開(kāi)辟了新的途徑，并為基于CRISPR i/a介導(dǎo)的增強(qiáng)子編輯技術(shù)干預(yù)T細(xì)胞功能和免疫治療提供了潛力靖榕。
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