1 PCR過程

圖1 PCR原理示意圖（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

變性-退火-延伸（圖1）。

2 過程細(xì)節(jié)

PCR中DNA的合成過程均以兩個(gè)引物特異性結(jié)合處為起點(diǎn)箕戳。

引物通常是分別取自靶DNA序列兩條鏈的3’端相向的長度在16~25nt的單鏈DNA片段，即引物頭是5’斟薇，尾是3’朵耕。引物自身為靶DNA一端的互補(bǔ)序列棵譬，最終成為產(chǎn)物的組成部分嫂侍。

耐熱的DNA聚合酶沾谓。在已發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶中，Taq pol的活性最高渗稍，達(dá)200000U/mg佩迟，反應(yīng)的最適溫度為75-80℃，此時(shí)延伸速率達(dá)150-300個(gè)核苷酸/（秒·酶分子）竿屹。該酶具5’->3’外切酶活性报强，不具3’->5’外切酶活性，故其不具Klenow酶的校對功能拱燃，在擴(kuò)增過程中引起堿基錯(cuò)配概率大大增加秉溉，概率約1/300-1/18000，在經(jīng)過25輪擴(kuò)增后碗誉，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列中平均每400個(gè)堿基就有一個(gè)與原始序列不同坚嗜。Taq pol具有類似脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶的活性（非模板依賴的聚合活性），特別對dATP的聚合能力最高诗充，利用這一特性，我們可以構(gòu)建dT-載體克隆dA尾的產(chǎn)物诱建。同樣蝴蜓，利用Klenow酶可以去除3’尾巴，生成平末端的產(chǎn)物俺猿。除Taq pol茎匠，人們還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和獲得了其他幾種耐熱DNA聚合酶，如Th DNA聚合酶押袍、Vent DNA聚合酶诵冒、Sac DNA聚合酶以及修飾Taq pol聚合酶等。

延伸溫度與時(shí)間谊惭。盡管Taq pol在75-80℃時(shí)活性最高汽馋，通常采用的延伸溫度為72℃，此時(shí)的堿基摻入率約35-100bp/s圈盔，因此延伸速率為1kb/min豹芯。通常擴(kuò)增1kb以內(nèi)的DNA片段延伸1min即可，而當(dāng)代增序列長達(dá)3-4kb時(shí)驱敲，則需延長3-4min铁蹈；然而當(dāng)擴(kuò)增小于150bp的片段時(shí)則可以省略延伸步驟，因?yàn)樵谕嘶饻囟认?em>Taq pol的活性已足以完成靶序列的合成众眨。通常PCR最后一輪循環(huán)中可以適當(dāng)將延長時(shí)間延長至4~10min握牧，以使PCR反應(yīng)完全提高擴(kuò)增產(chǎn)量容诬。在實(shí)際操作中，應(yīng)注意前幾輪循環(huán)的延伸時(shí)間要足夠沿腰，以使靶序列延伸完全從而提高PCR反應(yīng)的特異性览徒。此外當(dāng)待擴(kuò)增DNA濃度較低時(shí)，由于堿基摻入率較低矫俺，可適當(dāng)?shù)难娱L反應(yīng)延伸時(shí)間吱殉。

圖2 PCR過程與終產(chǎn)物（王廷華，2013）

PCR終產(chǎn)物分為復(fù)雜產(chǎn)物和長度特異產(chǎn)物兩部分（圖2）厘托。長度特異產(chǎn)物是長度嚴(yán)格限定在兩個(gè)引物鏈的5’端之間友雳，是特異的目標(biāo)片段。復(fù)雜產(chǎn)物片段是以包含有目標(biāo)序列的初始DNA片段為模板所合成的PCR產(chǎn)物铅匹，其5’端為引物序列押赊，而其3’端則遠(yuǎn)超出另一引物的結(jié)合區(qū)，以及以這樣的DNA鏈為模板包斑，另一引物結(jié)合并延伸形成的一端為雙鏈特異產(chǎn)物部分流礁，另一端為單鏈的復(fù)雜PCR產(chǎn)物。形成復(fù)雜產(chǎn)物片段的原因是：新合成的兩條DNA鏈5’端分別是兩引物的5’端罗丰，是固定不變的神帅，而3’端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一（其止點(diǎn)與模板長度萌抵、PCR延伸設(shè)定時(shí)間有關(guān)）找御。長度特異性產(chǎn)物因擴(kuò)增長度一致（反應(yīng)到目的片段的最后一個(gè)堿基即停止），而呈指數(shù)倍性（2ⁿ）增加绍填。復(fù)雜產(chǎn)物片段以算數(shù)倍數(shù)（2n）增加霎桅，且有多種長度類型，導(dǎo)致每個(gè)特定分子質(zhì)量的復(fù)雜產(chǎn)物片段的拷貝數(shù)很少讨永，相比長度特異性產(chǎn)物其在PCR總產(chǎn)物中幾乎可以忽略不計(jì)滔驶。這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物無需再純化，就能保證足夠的純度用于隨后的分析與檢驗(yàn)卿闹。

PCR產(chǎn)物量可用 P=N×(1+E)ⁿ 計(jì)算揭糕。P代表PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)，E代表平均每個(gè)熱循環(huán)的PCR擴(kuò)增效率锻霎，N代表起始模板拷貝數(shù)插佛，n代表熱循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率理論值為100%量窘，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值雇寇。產(chǎn)物增長整體呈現(xiàn)“指數(shù)-線形-平臺”模式（圖3）。初期，因DNA聚合酶活力足锨侯、dNTP底物充足嫩海，模板濃度低而自身復(fù)性少，PCR擴(kuò)增效率非常接近100%囚痴，產(chǎn)物呈現(xiàn)“指數(shù)”增長模式叁怪。隨反應(yīng)進(jìn)行，受DNA聚合酶活力下降等原因深滚，PCR效率接近0奕谭，最終停止反應(yīng)而進(jìn)入平臺期。絕大多數(shù)情況下痴荐，經(jīng)過35個(gè)循環(huán)血柳，PCR擴(kuò)增都將進(jìn)入到平臺期。

圖3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物隨循環(huán)數(shù)的變化生兆，產(chǎn)物量通過熒光強(qiáng)度表征（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

參考文獻(xiàn)：

[1] 王廷華, 劉佳, 夏慶杰. PCR理論與技術(shù)[M]. 第三版. 背景:科學(xué)出版社, 2013:1-22.