pubmed：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7606350
doi: 10.1016/j.humimm.2020.04.009

摘要

下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）已被廣泛用于臨床HLA分型和高級(jí)免疫遺傳學(xué)研究斤程。目前的方法在解決涉及遠(yuǎn)處變異位置的順式-反式歧義方面仍面臨挑戰(zhàn)，而且周轉(zhuǎn)時(shí)間受測(cè)試量和批次的影響币旧。納米孔測(cè)序可能成為現(xiàn)有HLA分型選擇的一個(gè)有希望的補(bǔ)充西剥。牛津納米孔技術(shù)公司(ONT)的MinION測(cè)序儀提供的技術(shù)可以記錄DNA/RNA鏈通過(guò)跨膜孔轉(zhuǎn)移時(shí)的離子電流變化涎拉，并將信號(hào)轉(zhuǎn)化為序列讀數(shù)。它的特點(diǎn)是庫(kù)的制備簡(jiǎn)單靈活，測(cè)序讀數(shù)長(zhǎng)开财，測(cè)序設(shè)備便攜且價(jià)格低廉培廓，測(cè)序速度快惹悄，實(shí)時(shí)性強(qiáng)。然而肩钠，測(cè)序讀數(shù)的錯(cuò)誤率很高泣港，仍然是其廣泛應(yīng)用的一個(gè)障礙。這篇評(píng)論文章將簡(jiǎn)要介紹這項(xiàng)技術(shù)价匠，然后重點(diǎn)討論利用納米孔測(cè)序技術(shù)進(jìn)行高分辨率HLA分型和免疫遺傳學(xué)研究的機(jī)會(huì)和挑戰(zhàn)当纱。

關(guān)鍵詞： 納米孔測(cè)序，下一代測(cè)序踩窖，人類(lèi)白細(xì)胞抗原坡氯，共識(shí)序列，測(cè)序錯(cuò)誤

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二代測(cè)序用于HLA分型

優(yōu)勢(shì)

• 克服PCR drop問(wèn)題
• 解決等位基因不平衡的局限

劣勢(shì)
不能很好地解決遠(yuǎn)距離突變phasing時(shí)順?lè)雌缌x問(wèn)題

三代測(cè)序用于HLA分型

優(yōu)勢(shì)

• 文庫(kù)制備簡(jiǎn)單靈活（無(wú)需酶打斷洋腮，即使是GC含量高的區(qū)域也能均勻覆蓋）
• 測(cè)序讀數(shù)長(zhǎng)
• 設(shè)備便攜
• 價(jià)格低廉
• 能夠解決遠(yuǎn)距離突變phasing時(shí)順?lè)雌缌x問(wèn)題

劣勢(shì)

• 測(cè)序讀數(shù)錯(cuò)誤率高
• 同聚物錯(cuò)誤（R10.3/10.4 nanopore可能提高均聚物的分辨率）

介紹

近年來(lái)廉沮，下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)已經(jīng)徹底改變了高分辨率的HLA分型。許多臨床實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)迅速采用這些技術(shù)徐矩，以商業(yè)化的檢測(cè)方法或真正的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法的形式對(duì)病人和供體進(jìn)行HLA分型滞时。兩種類(lèi)型的平臺(tái)促成了HLA分型方法的轉(zhuǎn)變：1）產(chǎn)生數(shù)百個(gè)堿基的短測(cè)序讀數(shù)的平臺(tái)，如羅氏454滤灯、Illumina和Ion Torrent坪稽，以及 2）產(chǎn)生數(shù)千個(gè)或更多堿基的長(zhǎng)讀數(shù)的PacBio平臺(tái)曼玩。其結(jié)果是很好的縮短了周轉(zhuǎn)時(shí)間，減少了模糊性窒百，提高了吞吐量黍判，以及更有成效的供體搜索結(jié)果。這些技術(shù)的實(shí)施也使免疫遺傳學(xué)研究領(lǐng)域充滿(mǎn)了活力篙梢，為最近的國(guó)際HLA和免疫遺傳學(xué)研討會(huì)提供了動(dòng)力顷帖，并擴(kuò)大了現(xiàn)有的HLA參考數(shù)據(jù)庫(kù)。

然而渤滞，生物技術(shù)的創(chuàng)新從未停止贬墩。(科學(xué)家)正在開(kāi)發(fā)不依賴(lài)于基于 PCR 的目標(biāo)富集的替代 HLA 分型策略，例如 HLA 基因的混合捕獲妄呕，然后是 NGS陶舞，以克服 PCR 丟失和等位基因不平衡的局限性（例如，來(lái)自布里斯班 CareDx 的 AlloSeq?Tx 17绪励， 加利福尼亞州）肿孵。 新穎而強(qiáng)大的生物信息學(xué)工具不斷涌現(xiàn)，可使用來(lái)自全基因組測(cè)序 (WGS)疏魏、全外顯子組測(cè)序和 RNA 測(cè)序的數(shù)據(jù)推斷 HLA 分型停做。 此外，(地球上)總會(huì)出現(xiàn)可能會(huì)產(chǎn)生重大影響的下一個(gè)小工具大莫。

在這里蛉腌，我們對(duì)納米孔測(cè)序進(jìn)行了簡(jiǎn)要回顧，重點(diǎn)關(guān)注其對(duì) HLA 分型和免疫遺傳學(xué)研究的潛在益處葵硕。 納米孔測(cè)序的原型由 Branton眉抬、Church、Deamer 及其同事于 1990 年代初在他們的學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室中率先提出懈凹。 第一個(gè)商用納米孔測(cè)序設(shè)備MinION于2014年由 Oxford Nanopore Technologies (ONT) 發(fā)布蜀变，此后已成功被獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室用于各種測(cè)序應(yīng)用。

MinION設(shè)備的剖析及其工作原理

MinION設(shè)備上的納米孔測(cè)序是由跨膜蛋白通道完成的介评，其納米級(jí)的孔徑剛好夠單鏈核酸聚合物通過(guò)库北。該孔位于一個(gè)抗電膜上，該膜將兩個(gè)電壓偏向的隔間分開(kāi)们陆。在單鏈DNA通過(guò)孔隙的轉(zhuǎn)移過(guò)程中寒瓦，離子電流的變化可以被傳感器連續(xù)記錄。這些信號(hào)隨后被分割成離散的事件坪仇，并通過(guò)計(jì)算破譯成占據(jù)孔隙的核苷酸序列的變化杂腰。單鏈RNA也可以直接進(jìn)行測(cè)序∫挝模化學(xué)的另一個(gè)關(guān)鍵組成部分是一種螺旋酶喂很，或運(yùn)動(dòng)蛋白惜颇，它能解開(kāi)雙鏈DNA并將單鏈DNA拉過(guò)孔。這種可控的少辣、類(lèi)似棘輪的過(guò)程增加了信噪比凌摄，允許以單堿基的分辨率辨別核苷酸。

單條DNA鏈通過(guò)孔隙的平均轉(zhuǎn)換速度為每秒450個(gè)堿基漓帅，這意味著對(duì)I類(lèi)HLA基因的全基因擴(kuò)增子（約4kb）進(jìn)行測(cè)序的時(shí)間不到10秒锨亏。一旦一條DNA鏈被完全轉(zhuǎn)移，同一個(gè)孔將立即可以對(duì)下一條進(jìn)行測(cè)序忙干。共有512個(gè)活性通道器予，每個(gè)通道由各自支架內(nèi)的四組納米孔組成，被嵌入一個(gè)MinION流動(dòng)池豪直。通過(guò)對(duì)依次通過(guò)流動(dòng)池上數(shù)百個(gè)活性孔的DNA分子進(jìn)行測(cè)序劣摇，可以實(shí)現(xiàn)高通量珠移。流動(dòng)池上的測(cè)序通道陣列安裝在一個(gè)傳感陣列和一個(gè)特定應(yīng)用集成電路（ASIC）的頂部弓乙，后者通過(guò)連接器引腳與MinION的底座相連。整個(gè)MinION設(shè)備钧惧，包括流動(dòng)池和底座暇韧，重約100克，可以裝入一個(gè)普通大小的口袋浓瞪。

根據(jù)所使用的文庫(kù)制備試劑盒懈玻，從輸入DNA樣品到測(cè)序數(shù)據(jù)的工作流程需要幾分鐘到幾小時(shí)。對(duì)于基于擴(kuò)增子的文庫(kù)乾颁，PCR擴(kuò)增子通常被純化和末端修復(fù)涂乌，然后在測(cè)序前連接到一個(gè)測(cè)序適配器上（圖1A，右圖）英岭。Y型適配器的一條鏈和另一條鏈上的運(yùn)動(dòng)蛋白相關(guān)聯(lián)湾盒，這使得文庫(kù)片段可以被吸附到孔中并通過(guò)孔隙棘輪。將文庫(kù)加載到流動(dòng)池后诅妹，一臺(tái)筆記本電腦或臺(tái)式電腦通過(guò)USB端口與MinION設(shè)備連接罚勾，在測(cè)序過(guò)程中為MinION供電并控制它。分段的序列事件（"斜線"）吭狡，或原始的離子電流信號(hào)尖殃，然后用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法進(jìn)行基礎(chǔ)調(diào)用，并將其分成高質(zhì)量（通過(guò)）或低質(zhì)量（失敾蟆）的讀數(shù)送丰，供下游分析。

HLA分型技術(shù)的差距弛秋。(A）傳統(tǒng)NGS（Illumina和Ion-torrent平臺(tái)的商業(yè)檢測(cè)）和納米孔測(cè)序的工作流程比較器躏。如果不進(jìn)行復(fù)用牵现，MinION可以選擇等克分子進(jìn)行pooling。(B) HLA-B基因座的部分覆蓋圖邀桑。使用基于酶的片段制備的文庫(kù)可以產(chǎn)生不均勻的覆蓋模式瞎疼。在受影響的樣本中，關(guān)鍵外顯子的覆蓋率可能很低（紅框）壁畸，導(dǎo)致錯(cuò)誤或不明確（i）贼急。相反，納米孔讀數(shù)覆蓋整個(gè)基因捏萍，沒(méi)有明顯的變化（ii）太抓。面板（i）和（iii）改編自參考文獻(xiàn)；面板（ii）是在作者的研究實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的令杈。

納米孔測(cè)序的優(yōu)缺點(diǎn)

納米孔測(cè)序是唯一不依賴(lài)于聚合酶催化的 DNA 合成的 NGS 技術(shù)走敌。幾個(gè)有吸引力的特性使該技術(shù)成為廣泛臨床和研究應(yīng)用的有前途的選擇。首先逗噩，快速靈活的文庫(kù)制備方案可以有效縮短從樣本到數(shù)據(jù)的時(shí)間掉丽。其次，納米孔測(cè)序可以產(chǎn)生數(shù)千到數(shù)百萬(wàn)個(gè)堿基的極長(zhǎng)讀數(shù)异雁，這僅受文庫(kù)中 DNA 片段大小的限制捶障。對(duì)于基因組學(xué)分析，這些長(zhǎng)讀適合phasing distant variants和interrogating結(jié)構(gòu)變異和低復(fù)雜性區(qū)域纲刀，這一直是短讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)的弱點(diǎn)项炼。第三，MinION 的價(jià)格實(shí)惠示绊，目前兩個(gè)流動(dòng)槽和一個(gè)測(cè)序試劑盒 (MinION Starter Pack) 的價(jià)格低至 1000 美元锭部，使用戶(hù)無(wú)需大量資本投資即可獲得 NGS。第四面褐，MinION 是一種便攜式設(shè)備拌禾，能夠在不受傳統(tǒng)空間和時(shí)間限制的情況下提供 NGS。在埃博拉病毒病流行期間盆耽，它被運(yùn)送到西非以對(duì)病毒基因組進(jìn)行測(cè)序以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疫情蹋砚。最后，納米孔測(cè)序不僅可以區(qū)分常規(guī) DNA 堿基摄杂，還可以區(qū)分 RNA 中的尿嘧啶和具有表觀遺傳修飾（例如甲基化）的核堿基坝咐，這種獨(dú)特的能力正在引領(lǐng)基因組學(xué)研究進(jìn)入 RNA 和基因組 DNA 分子直接測(cè)序的未知領(lǐng)域。

納米孔測(cè)序的上述特點(diǎn)可以潛在地解決HLA分型和免疫遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的一些未滿(mǎn)足的需求析恢，這一點(diǎn)將在以下章節(jié)中概述墨坚。另一方面，根據(jù)最近的報(bào)告，納米孔測(cè)序讀數(shù)的錯(cuò)誤率約為10-15%泽篮，仍然明顯高于短讀測(cè)序平臺(tái)盗尸。納米孔讀數(shù)的錯(cuò)誤率受測(cè)序化學(xué)和尋基算法的影響，Rang及其同事最近發(fā)表的一篇優(yōu)秀文章對(duì)此進(jìn)行了評(píng)論帽撑。鑒于HLA基因的復(fù)雜性泼各，以及密集的單核苷酸變體（SNVs）和偶爾的差異點(diǎn)，納米孔測(cè)序在HLA分型中的成功將取決于讀數(shù)準(zhǔn)確性的持續(xù)改善和開(kāi)發(fā)強(qiáng)大的生物信息學(xué)工具來(lái)克服任何持續(xù)存在的錯(cuò)誤亏拉。

用于 HLA 分型的納米孔測(cè)序

最近的一些出版物報(bào)道了納米孔測(cè)序用于HLA分型的一些早期嘗試扣蜻。這些研究大多通過(guò)長(zhǎng)范圍(片段)PCR富集目標(biāo)HLA基因，并使用各種文庫(kù)制備方法和納米孔測(cè)序化學(xué)方法對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序及塘，所有這些都是在該技術(shù)本身快速發(fā)展的情況下進(jìn)行莽使。商業(yè)軟件和學(xué)術(shù)生物信息學(xué)工具都被用來(lái)確定HLA分型，結(jié)果令人鼓舞（表1））笙僚。

使用納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行 HLA 分型的最新出版物

高效進(jìn)行文庫(kù)制備

在Illumina和Ion Torrent平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序的文庫(kù)準(zhǔn)備通常需要對(duì)目標(biāo)HLA基因的PCR擴(kuò)增子進(jìn)行基于酶的破碎芳肌。在分析過(guò)程中，數(shù)百個(gè)堿基的重疊肋层、短測(cè)序讀數(shù)被疊在一起亿笤，以確定樣品中存在的HLA等位基因。這種 "散彈槍 "方法通常需要一個(gè)由許多步驟組成的漫長(zhǎng)過(guò)程（圖1A槽驶，左側(cè)面板）责嚷。在擴(kuò)增和文庫(kù)制備過(guò)程中鸳兽，GC含量高的區(qū)域也可能被引入偏見(jiàn)掂铐，導(dǎo)致對(duì)關(guān)鍵外顯子的覆蓋不足（圖1B）。這個(gè)問(wèn)題可能與協(xié)議有關(guān)揍异，并已被證明在某些協(xié)議下會(huì)導(dǎo)致幾個(gè)HLA基因的模糊性或分型錯(cuò)誤全陨，但在同一實(shí)驗(yàn)室報(bào)告的其他協(xié)議下卻沒(méi)有那么明顯的問(wèn)題。通過(guò)每個(gè)基因座產(chǎn)生更多的測(cè)序讀數(shù)來(lái)增加可用于分析的數(shù)據(jù)可能會(huì)減輕這種風(fēng)險(xiǎn)衷掷，但要以效率為代價(jià)辱姨。另外，在最初的PCR反應(yīng)中加入了額外的引物戚嗅，以便在某些檢測(cè)中進(jìn)一步富集關(guān)鍵外顯子雨涛，以補(bǔ)償文庫(kù)制備過(guò)程中的負(fù)偏差。

相比之下懦胞，MinION可以對(duì)跨越整個(gè)HLA基因的長(zhǎng)程擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序替久，而不需要進(jìn)行片段化處理。納米孔測(cè)序也不需要在Illumina流動(dòng)池或Ion Torrent平臺(tái)的離子球顆粒上進(jìn)行克隆擴(kuò)增躏尉。因此蚯根，納米孔測(cè)序的文庫(kù)制備可以被大大簡(jiǎn)化（圖1A，右圖）胀糜÷梗可以通過(guò)兩種主要策略將條形碼添加到長(zhǎng)程擴(kuò)增子中蒂誉。首先，四聚體PCR可以使用具有5'適配器序列的HLA特異性?xún)?nèi)引物擴(kuò)增目標(biāo)基因距帅，然后使用具有重疊適配器序列和獨(dú)特條形碼序列的外引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增右锨。其次，條形碼片段可以直接連接到長(zhǎng)（范圍）擴(kuò)增子上碌秸。接下來(lái)陡蝇，帶有馬達(dá)蛋白和系帶的測(cè)序適配器可以通過(guò)結(jié)扎的方式加入到DNA雙鏈上，或者通過(guò)專(zhuān)有的快速連接反應(yīng)在一分鐘內(nèi)完成哮肚。完成這些程序的動(dòng)手時(shí)間通常為1-2小時(shí)登夫。由于納米孔方法消除了基于酶的斷裂所固有的偏差，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)目標(biāo)基因的均勻覆蓋允趟，包括具有高GC含量的區(qū)域（圖1B）恼策。

過(guò)去有一種選擇是對(duì)雙鏈分子的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序，這些雙鏈分子的一端由發(fā)夾連接物連接潮剪；另一端與運(yùn)動(dòng)蛋白和系帶連接到一個(gè)Y型測(cè)序適配器上涣楷。模板讀數(shù)和連接的互補(bǔ)讀數(shù)通過(guò)成對(duì)比對(duì)結(jié)合，生成所謂的2D讀數(shù)抗碰。這種文庫(kù)制備方案已不再可用狮斗。取而代之的是，可以通過(guò)在雙聯(lián)DNA的兩端加入Y形適配體并對(duì)兩條鏈進(jìn)行獨(dú)立測(cè)序來(lái)產(chǎn)生1D讀數(shù)弧蝇。這些讀數(shù)的錯(cuò)誤率比2D讀數(shù)高碳褒，但1D方法提高了文庫(kù)制備的效率和測(cè)序的產(chǎn)量。最近的幾項(xiàng)研究已經(jīng)證明了使用1D讀數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確HLA分型的可行性看疗。另一種被稱(chēng)為1D²的方法允許對(duì)雙聯(lián)分子的模板和互補(bǔ)鏈進(jìn)行順序測(cè)序沙峻，而不需要用發(fā)夾將它們物理連接起來(lái)。這種方法也能提高讀數(shù)的準(zhǔn)確性两芳，但還不能與擴(kuò)增子測(cè)序兼容摔寨。

為了提高納米孔測(cè)序讀數(shù)的準(zhǔn)確性，Li及其同事開(kāi)發(fā)了一種叫做INC-seq（分子內(nèi)連接的納米孔共識(shí)測(cè)序）的文庫(kù)制備方法怖辆。雙鏈DNA分子被自我連接以形成環(huán)狀DNA分子是复，然后進(jìn)行滾圓擴(kuò)增。擴(kuò)增子在MinION上進(jìn)行測(cè)序竖螃，產(chǎn)生具有重復(fù)單元的序列淑廊。基于相同來(lái)源的重復(fù)單元的共識(shí)序列顯示出超過(guò)97%的中位精度斑鼻，允許在物種水平上進(jìn)行精確的基于16S rRNA的細(xì)菌分析蒋纬。據(jù)我們所知，INC-seq在HLA分型中的應(yīng)用還沒(méi)有報(bào)道。INC-seq類(lèi)似于PacBio平臺(tái)上的單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測(cè)序蜀备，其中雙鏈DNA分子被轉(zhuǎn)化為單鏈環(huán)狀DNA关摇，在圓周上反復(fù)測(cè)序。產(chǎn)生多個(gè)相同來(lái)源的子讀數(shù)碾阁，并可將其結(jié)合起來(lái)输虱，為HLA分型創(chuàng)造高度準(zhǔn)確的共識(shí)讀數(shù)。

用于改進(jìn)單倍型相位的長(zhǎng)讀數(shù)

盡管短線程測(cè)序平臺(tái)上的NGS減少了涉及相距數(shù)百個(gè)堿基的變體的順?lè)雌缌x脂凶，但短線程測(cè)序讀數(shù)對(duì)相距更遠(yuǎn)的變體的能力是有限的宪睹。在我們最近對(duì)Ion Torrent S5儀器上用于兩場(chǎng)分辨率HLA分型的商業(yè)測(cè)定的評(píng)估中，我們?cè)?685個(gè)基因型中的26個(gè)（1.5%）遇到了跨不同外顯子的順?lè)葱阅：锨眨饕绊慔LA-A亭病、HLA-B、HLA-DPB1和HLA-DQB1位點(diǎn)嘶居。大多數(shù)模糊的基因型包括一個(gè)或兩個(gè)罕見(jiàn)的等位基因罪帖，可以用NMDP代碼報(bào)告，這種限制可能不是我們?cè)u(píng)估的方法或測(cè)序儀所特有的邮屁。對(duì)于Illumina測(cè)序文庫(kù)整袁，盡管讀數(shù)長(zhǎng)度較短，但用對(duì)端測(cè)序的方式加入較長(zhǎng)的片段可以在一定程度上改善遠(yuǎn)處變異體的相位佑吝。

納米孔測(cè)序的長(zhǎng)讀數(shù)可以很容易地phasing相距較遠(yuǎn)的變異位置坐昙。一個(gè)例子是基因型DQB1*06:03和DQB1*06:04與替代基因型DQB1*06:39和DQB1*06:41。由于橫跨第2外顯子和第3外顯子的順?lè)床幻鞔_芋忿，這兩種基因型無(wú)法用Ion Torrent的短讀數(shù)區(qū)分炸客。測(cè)序讀數(shù)必須連接兩個(gè)相距2668個(gè)堿基的變體位置，才能解決這個(gè)模糊問(wèn)題（圖2）盗飒。來(lái)自Illumina平臺(tái)的成對(duì)讀數(shù)可能也不能解決這些基因型嚷量，因?yàn)槿狈η『每缭竭@些變體位置的文庫(kù)片段。我們對(duì)DQB1的全基因擴(kuò)增子進(jìn)行了納米孔測(cè)序逆趣，產(chǎn)生了平均長(zhǎng)度為6654個(gè)堿基的測(cè)序讀數(shù)，這些讀數(shù)明確地支持在我們測(cè)試的一個(gè)樣品中分配DQB106:03和DQB106:04（圖2）嗜历。

圖2 用納米孔測(cè)序的長(zhǎng)讀數(shù)解決順式-逆式的模糊性宣渗。DQB1的全長(zhǎng)擴(kuò)增子測(cè)序的讀數(shù)與基因型DQB1*06:03:01:01和DQB1*06:04:01:01完全一致，覆蓋范圍均勻梨州，但與替代基因型DQB1*06:39和DQB1*06:41不一致痕囱。順式-反式的模糊性涉及到外顯子2和外顯子3的兩個(gè)變體位置，這兩個(gè)位置相距2668個(gè)堿基暴匠，Ion Torrent測(cè)序沒(méi)有解決這個(gè)模糊性問(wèn)題鞍恢。fold coverage顯示在每個(gè)覆蓋率圖的左上角。

經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、可擴(kuò)展且便攜的HLA分型

上述文庫(kù)制備和變異定向方面的優(yōu)勢(shì)并不是納米孔測(cè)序獨(dú)有的帮掉，因?yàn)镻acBio平臺(tái)也取得了類(lèi)似的進(jìn)展弦悉。然而，PacBio測(cè)序儀需要大量的資本投資和實(shí)驗(yàn)室空間蟆炊，而納米孔測(cè)序則消除了這種要求稽莉，使資源有限的小型HLA實(shí)驗(yàn)室能夠獲得NGS。如果納米孔測(cè)序開(kāi)始滲透到發(fā)展中國(guó)家的分子測(cè)試和HLA分型市場(chǎng)涩搓，這將不足為奇污秆。

納米孔測(cè)序的multiplexing能力和可擴(kuò)展性也影響了該平臺(tái)上HLA配型的成本。一臺(tái)MinION設(shè)備在優(yōu)化條件下每次運(yùn)行可產(chǎn)生高達(dá)50Gb的數(shù)據(jù)（https://nanoporetech.com）昧甘。這一數(shù)據(jù)產(chǎn)量在理論上可以為11個(gè)HLA基因提供2000倍的覆蓋率良拼，在一次運(yùn)行中大約有50個(gè)樣本multiplex，即使將運(yùn)行時(shí)間縮短一半至24小時(shí)充边，并排除不能被基線調(diào)用的低質(zhì)量讀數(shù)（約50%）将饺。目前，使用ONT公司的PCR Barcoding試劑盒可以索引多達(dá)96個(gè)樣本痛黎。上述的數(shù)據(jù)輸出和multiplex能力可能適合大多數(shù)醫(yī)院HLA實(shí)驗(yàn)室的需要予弧。但如果需要更高的吞吐量，該平臺(tái)可以通過(guò)GridION和PromethION設(shè)備進(jìn)行擴(kuò)展湖饱，每個(gè)設(shè)備可以分別產(chǎn)生250Gb和5.2Tb的數(shù)據(jù)掖蛤。
(24小時(shí)11個(gè)HLA基因，2000X覆蓋井厌，50個(gè)樣本蚓庭，共50G數(shù)據(jù))

在另一個(gè)方向，納米孔測(cè)序也可以用Flongle來(lái)縮小規(guī)模仅仆，這是一個(gè)有126個(gè)通道（相對(duì)于MinION的512個(gè)）的較小的流動(dòng)池器赞，與一個(gè)可重復(fù)使用的適配器一起使用。幾乎與測(cè)序通道數(shù)量的減少成正比墓拜，F(xiàn)longle的價(jià)格大約是MinION流動(dòng)池的四分之一港柜。每個(gè)流動(dòng)池的價(jià)格不到100美元，每次運(yùn)行時(shí)Flongle可以產(chǎn)生高達(dá)2Gb的數(shù)據(jù)咳榜。當(dāng)對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序時(shí)夏醉，我們每次運(yùn)行經(jīng)常獲得0.2-1.6Gb的數(shù)據(jù)，這取決于有多少庫(kù)被加載到流動(dòng)池上涌韩。更具未來(lái)感的是流水線上的SmidgION畔柔，它可能是最小的測(cè)序設(shè)備，可以插入智能手機(jī)進(jìn)行測(cè)序臣樱。有了這些更小靶擦、更便宜的流式細(xì)胞腮考，在小批量的樣本上進(jìn)行HLA分型的NGS，或在完全不分批的單一樣本上進(jìn)行NGS玄捕，將是負(fù)擔(dān)得起的踩蔚。De Santis及其同事使用Flongle流式細(xì)胞成功實(shí)現(xiàn)了11個(gè)HLA基因座的單樣本分型。這種前所未有的靈活性將使測(cè)試量小的實(shí)驗(yàn)室以及需要選擇緊急高分辨率HLA分型的大型實(shí)驗(yàn)室受益桩盲。

快速寂纪、實(shí)時(shí)的 HLA 分型

納米孔測(cè)序不需要像Illumina或Ion Torrent平臺(tái)那樣用固定的測(cè)序時(shí)間來(lái)完成預(yù)定的周期數(shù)。相反赌结，測(cè)序讀數(shù)可以實(shí)時(shí)生成和調(diào)用基數(shù)捞蛋，然后進(jìn)行下游數(shù)據(jù)分析。這些特點(diǎn)使得通過(guò)測(cè)序快速進(jìn)行HLA分型成為可能柬姚，因?yàn)樾枰嗌贂r(shí)間來(lái)產(chǎn)生足夠的讀數(shù)覆蓋率以滿(mǎn)足預(yù)期的應(yīng)用拟杉。我們觀察到，在MinION R9.4流動(dòng)池上測(cè)序的半小時(shí)內(nèi)可以產(chǎn)生覆蓋全長(zhǎng)I類(lèi)基因的數(shù)千條長(zhǎng)讀數(shù)量承，并且可以利用這些數(shù)據(jù)確定準(zhǔn)確的HLA分型（圖3）搬设。考慮到整個(gè)HLA分型過(guò)程撕捍，包括DNA提饶醚ā（約1小時(shí)）、PCR富集目標(biāo)（約3小時(shí)）忧风、ONT文庫(kù)制備（約2小時(shí)）默色、納米孔測(cè)序（約0.5-1.5小時(shí)）和數(shù)據(jù)分析（約0.5小時(shí)），在ONT平臺(tái)上開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)方法狮腿，在幾小時(shí)內(nèi)通過(guò)NGS完成高分辨率的HLA分型變得現(xiàn)實(shí)腿宰。話雖如此，不同的測(cè)序速度可能會(huì)有很大的不同（圖3缘厢，比較左吃度、右圖），為了實(shí)現(xiàn)可預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)輸出贴硫，流程的標(biāo)準(zhǔn)化將是必要的椿每。

在MinION上對(duì)I類(lèi)HLA基因進(jìn)行快速測(cè)序。使用R9.4 MinION流式細(xì)胞對(duì)樣本1（左圖）和樣本2（右圖）的三個(gè)I類(lèi)HLA基因的全基因擴(kuò)增子1D庫(kù)進(jìn)行了兩次獨(dú)立的測(cè)序夜畴。高質(zhì)量測(cè)序讀數(shù)的數(shù)量（右軸）和基于關(guān)鍵外顯子的分型結(jié)果的準(zhǔn)確性（左軸）隨時(shí)間變化而變化拖刃。兩個(gè)樣本的共識(shí)序列在15分鐘內(nèi)與參考等位基因（外顯子2和3）的序列完全匹配。在1贪绘、5和10分鐘內(nèi)，樣本1的共識(shí)序列和參考序列之間的錯(cuò)配總數(shù)為1央碟、1和1税灌，樣本2為4均函、4和1。

此外菱涤，在多重測(cè)序分析中苞也，每個(gè)樣本和每個(gè)位點(diǎn)的目標(biāo)測(cè)序讀數(shù)數(shù)量可能會(huì)因PCR試劑和文庫(kù)匯集過(guò)程的精度而有很大差異。 確保所有目標(biāo)基因和樣本的平衡表示以最大限度地提高基于NGS的HLA分型的多重能力至關(guān)重要粘秆。 雖然引物組合的優(yōu)化和過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化至關(guān)重要如迟，但目標(biāo)擴(kuò)增子的平衡測(cè)序有可能通過(guò)Loose及其同事開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)選擇性測(cè)序在ONT平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)。 該過(guò)程是通過(guò)開(kāi)源“Read Until”軟件實(shí)現(xiàn)的攻走，該軟件將離子電流追蹤（分段的順序事件或“波浪形”數(shù)據(jù)）與波浪形空間中的參考序列實(shí)時(shí)匹配殷勘。 如果為前250個(gè)“事件”識(shí)別出正確的匹配，則擴(kuò)增子被視為來(lái)自目標(biāo)區(qū)域昔搂，并將被選擇性地排序玲销，直到達(dá)到預(yù)先指定的目標(biāo)（例如，特定的覆蓋深度）摘符。 來(lái)自脫靶區(qū)域的擴(kuò)增子被相應(yīng)孔隙中的電壓反轉(zhuǎn)所拒絕贤斜。 來(lái)自已被充分覆蓋的目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增子也被拒絕。 該方法有效地優(yōu)先排序多個(gè)目標(biāo)區(qū)域并標(biāo)準(zhǔn)化它們的覆蓋率逛裤，這將有利于多個(gè)HLA基因的基于擴(kuò)增子的分型設(shè)置瘩绒。 盡管該方法似乎對(duì)計(jì)算要求很高，但它有可能針對(duì)更廣泛的應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化带族。

生物信息學(xué)

使用長(zhǎng)而嘈雜的納米孔測(cè)序讀數(shù)進(jìn)行 HLA 分型需要生物信息學(xué)解決方案锁荔，不同于那些為從 Illumina 和 Ion Torrent 平臺(tái)獲得更短但更準(zhǔn)確的讀數(shù)而設(shè)計(jì)的解決方案。最近發(fā)表了一篇關(guān)于使用 NGS 數(shù)據(jù)進(jìn)行 HLA 分型的生物信息學(xué)的優(yōu)秀而全面的評(píng)論炉菲。本節(jié)將重點(diǎn)介紹使用納米孔讀取進(jìn)行 HLA 分型的生物信息學(xué)方法堕战。

第一次嘗試通過(guò)早期版本的 MinION（R7.3 流動(dòng)槽）上的擴(kuò)增子測(cè)序?qū)?HLA-A 和 -B 基因進(jìn)行分型，但沒(méi)有成功拍霜，四個(gè)等位基因中有四個(gè)被錯(cuò)誤分配嘱丢。結(jié)果可以用早期納米孔讀取的高錯(cuò)誤率和當(dāng)時(shí)缺乏定制的生物信息學(xué)工具來(lái)解釋。GATK HLACaller 最初是為 454 平臺(tái)的短讀取而設(shè)計(jì)的祠饺，在本研究中用于分配 HLA 等位基因越驻，結(jié)果證明該算法與容易出錯(cuò)的納米孔讀取不兼容。隨著測(cè)序化學(xué)和堿基識(shí)別方法的不斷改進(jìn)道偷，使用遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法進(jìn)行堿基識(shí)別缀旁，R9.4/R9.5 流動(dòng)槽的 1D reads 的讀取錯(cuò)誤率一直徘徊在 85-90% 左右。隨后使用這些噪聲讀數(shù)進(jìn)行 HLA 分型的努力探索了如下概述的三種主要策略：1) 一致等位基因匹配勺鸦，2) 基于圖形對(duì)齊的等位基因分配并巍，以及 3) 等位基因特異性讀數(shù)聚類(lèi)和分層評(píng)分。

在足夠覆蓋的情況下换途，共識(shí)序列可以有效地糾正單個(gè)納米孔讀數(shù)中的隨機(jī)錯(cuò)誤懊渡。使用 Canu刽射、Freebayes、Nanocorrect 和 Racon 等工具剃执，單獨(dú)使用納米孔讀取對(duì)同源單倍體樣品生成了高質(zhì)量的共有序列誓禁。例如，Loman 及其同事開(kāi)發(fā)了 Nanocorrect 以從頭組裝大腸桿菌 K-12 MG1655 基因組肾档，并開(kāi)發(fā)了 Nanopolish 以使用波形（信號(hào)級(jí)）數(shù)據(jù)改進(jìn)組裝摹恰。該方法以約 29 倍的理論覆蓋率實(shí)現(xiàn)了 99.5% 的核苷酸同一性，展示了克服讀取級(jí)噪音的潛在途徑怒见。對(duì)于通過(guò) MinION 上的擴(kuò)增子測(cè)序進(jìn)行的基于一致性的 HLA 分型俗慈，我們開(kāi)發(fā)了 Athlon 管道，首先通過(guò)兩個(gè)過(guò)程在 I 類(lèi) HLA 位點(diǎn)識(shí)別一個(gè)（純合）或兩個(gè)（雜合）候選等位基因：1）讀取映射到集合IMGT/HLA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知參考序列速种，以及 2) 比較抗原和等位基因水平的總讀取深度姜盈。接下來(lái)，使用 Freebayes用于重新排列到每個(gè)候選等位基因的讀數(shù)配阵。最后馏颂，將共有序列與 IMGT/HLA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，并選擇最匹配的等位基因進(jìn)行最終分配棋傍。這項(xiàng)概念驗(yàn)證研究考慮了編碼抗原識(shí)別域 (ARD) 的外顯子 2 和 3救拉。在此分辨率下，Athlon 使用來(lái)自 R9.4 流動(dòng)槽的2D讀數(shù)或1D讀數(shù)實(shí)現(xiàn)了 100% 的準(zhǔn)確度瘫拣。盡管結(jié)果令人鼓舞亿絮，但如降采樣分析所示，需要相對(duì)較高的覆蓋率（每個(gè)位點(diǎn)≥ 1000 個(gè) 1D 讀數(shù)）麸拄。除了 2-field 級(jí)別的分型分辨率限制（僅考慮管道的關(guān)鍵外顯子）派昧，Athlon 可能容易受到等位基因丟失的影響，具體取決于文庫(kù)中的等位基因平衡拢切，并且在發(fā)表時(shí)無(wú)法處理 II 類(lèi) HLA 分型蒂萎。即使在納米孔讀取的共識(shí)序列和基本事實(shí)之間的同一性接近99.9% ，對(duì)于典型的 I 類(lèi)等位基因（全長(zhǎng)約 4,000 個(gè)堿基）的共識(shí)中可能存在大約 4 個(gè)錯(cuò)誤堿基淮椰，這將使最終等位基因分配五慈。當(dāng) Athlon 將分析限制在總長(zhǎng)度小于 600 個(gè)堿基的關(guān)鍵外顯子時(shí)，這種效果可能不明顯主穗。如果這些殘留誤差代表納米孔測(cè)序化學(xué)或堿基調(diào)用方法固有的系統(tǒng)誤差泻拦，則可能難以完全消除。

圖比對(duì)策略不是將測(cè)序讀數(shù)映射到參考序列集合忽媒，而是識(shí)別測(cè)序讀數(shù)和群體參考圖 (PRG) 之間的線性比對(duì)争拐，該參考圖將已知參考序列組合到目標(biāo)基因內(nèi)變異的生成模型中。對(duì)于最終 HLA 類(lèi)型的推斷晦雨，對(duì)所有比對(duì)進(jìn)行評(píng)分陆错，并報(bào)告 G 組分辨率下最可能的潛在等位基因?qū)Φ婆住Ｔ摬呗宰畛踝鳛?HLA*PRG 實(shí)施金赦，用于來(lái)自 Illumina 平臺(tái)的全基因組測(cè)序 (WGS) 數(shù)據(jù)音瓷，并在分析的 158 個(gè)等位基因中實(shí)現(xiàn)了 99.4% 的準(zhǔn)確率。HLA*PRG 的一個(gè)警告是其高計(jì)算要求夹抗。一個(gè)改進(jìn)的實(shí)現(xiàn)绳慎，HLA*LA，允許通過(guò)逐步過(guò)程優(yōu)化投影在 PRG 上的線性對(duì)齊漠烧，包括對(duì)齊檢查杏愤、拋光和擴(kuò)展。HLA*LA支持分析更多樣化的NGS數(shù)據(jù)類(lèi)型已脓。與來(lái)自 Illumina 平臺(tái)的外顯子組和低覆蓋率 WGS 數(shù)據(jù)相比珊楼，HLA*LA 與其他變異感知比對(duì)方法（包括 HLA*PRG、Kourami 和 xHLA 相比顯示出同等或更高的準(zhǔn)確性）度液。重要的是厕宗，HLA*LA 是唯一一個(gè)基于圖形對(duì)齊的程序，已被證明可以成功分析來(lái)自 PacBio 和納米孔平臺(tái)的noisy long reads堕担，目標(biāo)測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度范圍為 95% 到 100%已慢。如果使用額外的納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，圖形對(duì)齊方法可以為 G 組分辨率下的 HLA 分型提供一個(gè)極好的選擇霹购。

Klasberg 及其同事最近報(bào)道了用于基于擴(kuò)增子的 HLA 分型的 nanotyper 管道佑惠，其特點(diǎn)是讀取聚類(lèi)和分層評(píng)分。使用這種方法齐疙，納米孔reads首先被映射到目標(biāo)基因的通用參考膜楷，然后聚集到等位基因特異性reads集中。聚類(lèi)是基于多態(tài)性位置實(shí)施的贞奋，這些多態(tài)性位置具有相位信息并且不太可能是測(cè)序偽影赌厅。接下來(lái)，每個(gè)等位基因特異性組中的讀數(shù)用于創(chuàng)建多序列比對(duì)忆矛，最終基因型由分級(jí)評(píng)分確定察蹲，分級(jí)評(píng)分優(yōu)先考慮關(guān)鍵外顯子，然后是非關(guān)鍵外顯子催训，然后是非編碼序列洽议。作者確定了 94 個(gè)樣本中的 4 字段 HLA 分型，這些樣本以 Illumina 和 PacBio 測(cè)序生成的基因型為基準(zhǔn)漫拭。I 類(lèi)基因的一致性率為 99.4–100%亚兄，HLA-DQB1 的一致性率為 95%，其中 60% 的結(jié)果是明確的采驻。確定了兩個(gè)主要的歧義來(lái)源审胚，一個(gè)是 3'-UTR 的不完整覆蓋匈勋，另一個(gè)是由于未能區(qū)分不同長(zhǎng)度的均聚物軌道。隨著該方法的不斷成熟膳叨，特別是對(duì)于所有相關(guān)的 II 類(lèi)位點(diǎn)洽洁，納米孔測(cè)序可能成為超高分辨率 HLA 分型的有力競(jìng)爭(zhēng)者。

除了上述學(xué)術(shù)生物信息學(xué)工具菲嘴，一些商業(yè)軟件如 SeqPilot（JSI medical systems GmbH饿自，德國(guó)）和 NGSengine（GenDx，烏得勒支龄坪，荷蘭）也被用于分析納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)以進(jìn)行 HLA 分型昭雌，并取得了可喜的結(jié)果。 然而健田，均聚物錯(cuò)誤將繼續(xù)成為該應(yīng)用中的主要挑戰(zhàn)烛卧，因?yàn)閿U(kuò)展的均聚物軌道（> 5 聚體）通過(guò)納米孔的易位不會(huì)引起離子電流信號(hào)的變化； 由于易位速度不均勻妓局，無(wú)法可靠地推斷出均聚物區(qū)域內(nèi)的堿基數(shù)量总放。 一種折衷方案是在等位基因分配期間將這些困難區(qū)域排除在決策制定之外，尤其是當(dāng)它們位于內(nèi)含子中時(shí)跟磨，并接受增加的歧義间聊。 納米孔讀數(shù)相對(duì)較高的錯(cuò)誤率和同聚物問(wèn)題也使得確定現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在的新等位基因的存在具有挑戰(zhàn)性。 結(jié)合來(lái)自納米孔測(cè)序和其他方法的數(shù)據(jù)的混合共識(shí)方法在這種情況下可能有用抵拘，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)出色的定相和準(zhǔn)確性哎榴。 為了最終根除問(wèn)題，納米孔設(shè)計(jì)和堿基識(shí)別方法的創(chuàng)新將是必要的僵蛛。最新的 R10.3 納米孔具有更長(zhǎng)的通道尚蝌，具有相互分離的雙識(shí)別位點(diǎn)，以提高均聚物軌道的分辨率充尉。 這一新發(fā)展的全面驗(yàn)證和整合可能會(huì)提高納米孔測(cè)序的性能飘言，并在不久的將來(lái)使該技術(shù)有資格用于臨床 HLA 分型。

結(jié)論和未來(lái)方向

納米孔測(cè)序是一項(xiàng)獨(dú)特的技術(shù)驼侠，它通過(guò)獨(dú)立于核酸合成的化學(xué)方法對(duì) DNA/RNA 鏈進(jìn)行測(cè)序姿鸿。它有可能提供快速、便攜且廉價(jià)的高分辨率 HLA 分型倒源，并且沒(méi)有順?lè)雌缌x苛预。文庫(kù)制備過(guò)程簡(jiǎn)單靈活，為創(chuàng)新提供了沃土笋熬。納米孔讀取的長(zhǎng)度僅受文庫(kù)片段長(zhǎng)度的限制热某，文庫(kù)片段可以跨越整個(gè) HLA 基因和轉(zhuǎn)錄本。該技術(shù)還具有直接檢測(cè)表觀遺傳修飾的能力，這是一個(gè)了不起的突破昔馋，可能會(huì)導(dǎo)致免疫遺傳學(xué)研究的新發(fā)現(xiàn)筹吐。

納米孔測(cè)序在臨床分子檢測(cè)和HLA分型中廣泛應(yīng)用的最大障礙是測(cè)序reads的高錯(cuò)誤率。通過(guò)納米孔測(cè)序進(jìn)行 HLA 分型的累積樣本量在文獻(xiàn)中仍然很小秘遏，與其他 NGS 平臺(tái)測(cè)序的樣本數(shù)量相比相形見(jiàn)絀 4 , [6]]. 此外丘薛，現(xiàn)有 NGS 平臺(tái)的出色性能提高了我們對(duì)以近乎完美的準(zhǔn)確性進(jìn)行全基因表征的期望。納米孔測(cè)序必須滿(mǎn)足現(xiàn)有 NGS 平臺(tái)制定的高標(biāo)準(zhǔn)垄提，才有資格進(jìn)行臨床 HLA 分型榔袋。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，需要新穎的生物信息學(xué)工具和經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的商業(yè)軟件包來(lái)從嘈雜的納米孔讀數(shù)中生成準(zhǔn)確的分型結(jié)果铡俐。并且，隨著納米孔設(shè)計(jì)和堿基識(shí)別方法的不斷改進(jìn)妥粟，納米孔測(cè)序可能會(huì)在不久的將來(lái)實(shí)現(xiàn)為 HLA 分型和免疫遺傳學(xué)研究提供強(qiáng)大且多功能的平臺(tái)的承諾。

phasing distant variants：phasing可以認(rèn)為是變異定向、基因定相顿颅、基因分型哑舒、單倍體分型、單倍體構(gòu)建等國(guó)車(chē)過(guò)播急，指二代測(cè)序無(wú)法較好地將來(lái)自同一親本的SNP連接起來(lái)脓钾，在這里三代測(cè)序能夠較好地克服這個(gè)問(wèn)題。
cis-trans ambiguity：DNA-based typing of HLA alleles occasionally results in the inability to assign a specific allele because of ambiguity in associating two or more polymorphisms to the same or to alternate homologs (cis/trans ambiguity). 相對(duì)同一染色體或DNA分子而言為“順式”（cis）桩警；對(duì)不同染色體或DNA分子而言為“反式”（trans）（來(lái)自百度百科詞條：順式作用元件）可训。其它參考https://www.gendx.com/SBTengine/Help_220/hs290.htm
G group resolution：G 組分辨率決定編碼肽結(jié)合凹槽的外顯子序列，即 I 類(lèi)和 II 類(lèi)基因的外顯子2和3捶枢。
homopolymer error：Homopolymers are stretches of mono nucleotides (DNA bases) greater than two bases long which occur together. So for instance, 'ATCCCCGC' has a homopolymer of length 4 (base 'C'). These stretches are quite infamous for being sources of errors while sequencing DNA. 參考https://medium.com/@sanatmishra1/homopolymers-repeats-errror-eror-error-137d69031f30

關(guān)于1D/2D/1D²

Oxford Nanopore Technologies 開(kāi)發(fā)的 1D握截、2D 和 1D²測(cè)序方法的示意圖。 使用一維化學(xué)時(shí)烂叔，只有模板鏈（藍(lán)色）被運(yùn)動(dòng)蛋白（綠色）穿線谨胞。 互補(bǔ)鏈（紅色）被丟棄并測(cè)序。 當(dāng)使用 2D 化學(xué)時(shí)蒜鸡，模板和補(bǔ)體都被測(cè)序胯努，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^(guò)發(fā)夾（黃色）連接在一起。 1D²化學(xué)也允許對(duì)兩條鏈進(jìn)行測(cè)序逢防，但不是連接兩條鏈叶沛，而是在對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序時(shí)將互補(bǔ)鏈拴在膜上。 隨后胞四，互補(bǔ)鏈被吸入恬汁，系繩被拉松。