??分析差異翻譯基因時(shí)蜕衡，為了保證結(jié)果的正確性李滴，除了使用Xtail軟件外突硝，也用riborex分析了一遍测摔，該軟件封裝了常規(guī)轉(zhuǎn)錄組常用的三種差異分析框架DESeq2、edgeR解恰、Voom锋八。另外，該軟件還封裝了fdrtool可以用來(lái)矯正pvalue护盈。具體的代碼示例可以參考軟件文檔挟纱，這里就不演示了，主要說(shuō)說(shuō)使用軟件時(shí)需要注意的事項(xiàng)腐宋。
詳細(xì)的使用說(shuō)明書(shū)：
https://github.com/smithlabcode/riborex/blob/master/vignettes/riborex.pdf
??DESeq2做為常規(guī)轉(zhuǎn)錄組最常用的差異表達(dá)基因分析的框架紊服，確實(shí)是一個(gè)不可多得的選擇檀轨。同時(shí)财边，也對(duì)翻譯組差異翻譯基因的鑒定有著很大的影響衬衬，很多翻譯組的差異分析軟件也是基于這些框架而來(lái)奄喂。因此，這里說(shuō)的注意事項(xiàng)是選擇DESeq2做為riborex的分析引擎時(shí)剂府，需要注意的地方。
??用DESeq2做差異分析時(shí)剃盾，最后提取差異結(jié)果時(shí)腺占，默認(rèn)設(shè)計(jì)矩陣中前面的分組做為參考，也可以提供contrast參數(shù)痒谴，指定如何提取結(jié)果衰伯，確定哪一個(gè)分組做為參考，弄不好得到的結(jié)果可能跟預(yù)期相反积蔚。例如意鲸，分組變量名為group，含有case尽爆、ctrl兩個(gè)水平怎顾，那么最后提取差異時(shí)，可以用兩種方式指定：
res <- results(dds, contrast=c("group", "case", "ctrl"))
# 或者下面的方式
res <- results(dds, name="group_case_vs_ctrl")
??要明白放在后面的組名如ctrl是做為對(duì)照組的漱贱，如果case放在后面就會(huì)導(dǎo)致上下調(diào)基因反過(guò)來(lái)槐雾。雖然不是什么大問(wèn)題，但有可能引起誤導(dǎo)而浪費(fèi)不必要的時(shí)間幅狮。
??那么募强，riborex使用DESeq2做為引擎分析差異基因時(shí)，最后也要根據(jù)contrast提取差異結(jié)果崇摄。例如擎值，軟件文檔示例數(shù)據(jù)的分組情況如下：
rnaCond <- c("control", "control", "treated", "treated")
riboCond <- c("control", "control", "treated", "treated")
??雖然軟件也提供了contrast參數(shù)用于指定如何提取，但好像該參數(shù)并那么好使逐抑。默認(rèn)情況下幅恋，contrast無(wú)需指定，與DESeq2默認(rèn)情況一樣泵肄，前面的分組做為參考捆交，即control為對(duì)照。但是腐巢，類(lèi)似文檔中只有Multi-factor experiment的示例格式指定這個(gè)參數(shù)：
??然而品追，不是Multi-factor experiment，該怎么辦呢冯丙？比如樣本分組情況如下：
rnaCond <- c("case", "case", "ctrl", "ctrl")
riboCond <- c("case", "case", "ctrl", "ctrl")
??通常習(xí)慣以對(duì)照組為參考肉瓦，看處理組如何變化遭京，默認(rèn)的結(jié)果是以case做為參考，這顯然有點(diǎn)反人類(lèi)泞莉。如果想得到以ctrl為參考的結(jié)果哪雕，該怎么辦呢？
??因?yàn)檐浖?code>contrast參數(shù)鲫趁，所以第一時(shí)間想到用這個(gè)參數(shù)提取想要的結(jié)果斯嚎，可是看了一圈發(fā)現(xiàn)不知道如何提供參數(shù)，也是無(wú)奈挨厚。當(dāng)然堡僻，此路不通還有別的選擇，比如可以將樣本順序顛倒一下就可以了疫剃，這樣默認(rèn)情況就是想要的結(jié)果钉疫。
??沒(méi)辦法，咱還是想搞清楚怎么提供參數(shù)巢价，就去看了看軟件的源碼牲阁，關(guān)于contrast參數(shù)的代碼如下：
??這段代碼的else部分代碼寫(xiě)法有點(diǎn)怪異，提供的contrast第一個(gè)元素要在combinedCond列名里面壤躲，而咱們根本不知道combinedCond內(nèi)容是什么咨油。既然倒騰了，那就倒騰明白吧柒爵，可以通過(guò)下面的方式提供參數(shù)：
contrast <- c('cond', 'case', 'ctrl')
res <- riborex(rna, ribo, rnaCond, riboCond, "DESeq2", contrast = contrast)
??contrast第一個(gè)元素得是cond役电，已經(jīng)由代碼的邏輯固定了。
??事實(shí)上棉胀，riborex只是封裝了DESeq2法瑟，咱們也可以自行構(gòu)建設(shè)計(jì)矩陣，直接使用DESeq2來(lái)做差異翻譯基因分析唁奢。
protocol + condition + condition:protocol
??protocol為RNAseq和riboseq各樣本的分組向量霎挟，condition為樣本所屬的數(shù)據(jù)類(lèi)型分組向量，condition:protocol為前面兩個(gè)的交互效應(yīng)麻掸。
??riborex與xtail的結(jié)果重合度挺好酥夭，而xtail的結(jié)果更為保守，想要多一些的結(jié)果可以選擇前者脊奋。
