Western blot (蛋白印跡)
WB是一種把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持物(NC膜或PVDF膜)冀墨，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測。WB采用抗體作為探針献丑，抗體可以與附著在固相支持物的靶蛋白的抗原表位發(fā)生抗原-抗體免疫反應(yīng)末捣。這種技術(shù)的作用是對細(xì)胞或組織提取的蛋白混合物(即總蛋白混合物)中的某一特異蛋白進行鑒別和半定量分析，旨在鑒別特異性蛋白的類型(如亞型创橄、聚體箩做、剪切體等)和蛋白表達(dá)量的變化。
其基本流程如下：
前面·我們已經(jīng)介紹過SDS-PAGE妥畏，電泳完成后如果要進行western blot則需要轉(zhuǎn)膜
轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)兩種不同方法邦邦。我用的是半干轉(zhuǎn)移法安吁，膜覆蓋住膠，膜用balance buffer潤濕（甲醇溶液）,蓋子分別用top buffer和bottom buffer潤濕后蓋住圃酵，轉(zhuǎn)膜10min柳畔。
注意：
1：膜大小合適，防止浪費.
2：蓋好膜和凝膠后郭赐，凝膠薪韩、膜 推平，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全捌锭。
3：注意一定要戴手套或塑料鑷子接觸膜俘陷，避免手上的蛋白和油脂降低轉(zhuǎn)膜效率。
封閉：降低背景观谦，占據(jù)膜上剩余的結(jié)合位點拉盾，使抗體只能與膜上的抗原特異性結(jié)合，一般用的是5%的脫脂奶粉豁状，但值得注意的是對于磷酸化的抗體或生物素標(biāo)記的抗體不能用脫脂奶粉捉偏，只能用5%的BSA。封閉時間室溫1-2h泻红。
一抗孵育：封閉結(jié)束后夭禽，用PBST稍微洗膜后倒掉，再加入PBST搖10min谊路，反復(fù)洗三次后加入0.5%一抗+3%奶粉進行孵育2h讹躯，一般5mL，但上次我用10mL缠劝。一抗孵育時潮梯，要注意一抗的種屬來源，我用的his標(biāo)簽惨恭，所以一抗是anti-his秉馏。一抗可以反復(fù)使用2-3次。
PBST 溶液? PBS 溶液中加入 0.1%吐溫
洗膜：用PBST進行洗膜脱羡，10min/次沃饶，洗3-4次即可。
二抗孵育：洗膜結(jié)束后轻黑，后加入0.3%二抗+3%奶粉5mL孵育1h糊肤，再次洗膜。注意二抗的種屬要與一抗的來源相對應(yīng)氓鄙，例如我的一抗是鼠抗馆揉，我的二抗是羊抗鼠。
檢測：按 1：1 比例吸取顯影液中的 A 液和 B 液于 1.5 mL EP 管中混合抖拦，一塊膠100μL升酣，后將混合液均勻滴加在 PVDF 膜上舷暮，用塑封袋將 PVDF 膜封好，放入顯影儀中進行顯影 (速度要快噩茄，盡量減少底物消耗)下面。
