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Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease and medicine

導(dǎo)讀：在過去的10年里朽色，單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)的進(jìn)步對生物醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了革命性的影響邻吞，使單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的分辨率和吞吐量達(dá)到前所未有的水平（先籠統(tǒng)的說單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在過去產(chǎn)生的影響以及實現(xiàn)的水平，接下來開始整體具體陳述其應(yīng)用-4點（細(xì)胞水平分析與Zoom in比較）葫男。具體來說抱冷，scRNA-seq促進(jìn)了新細(xì)胞或罕見細(xì)胞類型的鑒定，單細(xì)胞軌跡構(gòu)建和干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化的分析梢褐，以及在單細(xì)胞分辨率下健康和疾病相關(guān)組織的比較旺遮。（描述了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在整體具體上的作用，研究人員又開始闡述在心血管領(lǐng)域中的具體作用）在過去的十年中盈咳，這些應(yīng)用已經(jīng)在心血管研究的進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用耿眉，證明了哺乳動物心臟和血管細(xì)胞圖集的生成，闡明了心血管發(fā)育和干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化的機(jī)制鱼响。在本文中鸣剪，研究人員總結(jié)了目前可用的scRNA-seq技術(shù)和分析工具，并討論了使用scRNA-seq的最新發(fā)現(xiàn)丈积，這些發(fā)現(xiàn)極大地提高了我們對心血管系統(tǒng)的發(fā)展和心血管疾病的機(jī)制的認(rèn)識筐骇。此外，研究人員還研究了整合多模式單細(xì)胞平臺的新興策略江滨，重點關(guān)注未來在心血管精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用拥褂，即使用單細(xì)胞組學(xué)方法來表征細(xì)胞對藥物或環(huán)境刺激的特異性反應(yīng)，并開發(fā)有效的患者特異性治療方法（重點闡明三點）牙寞。

論文ID

原名：Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease and medicine

譯名：單細(xì)胞RNA測序在心血管發(fā)育饺鹃、疾病與醫(yī)學(xué)中的研究

期刊：Nature Reviews /Cardiology

IF：20.26

發(fā)表時間：202008

通訊研究人員：Joseph C. Wu

通訊研究人員單位：斯坦福大學(xué)心血管學(xué)院

DOI號：10.1038/s41569-020-0359-y??

實驗設(shè)計

介紹

傳統(tǒng)的bulk測序技術(shù)與PCR等技術(shù)檢測的是細(xì)胞群體水平的基因平均表達(dá)情況莫秆，這可能在高異質(zhì)性細(xì)胞群與轉(zhuǎn)錄組差異的研究中產(chǎn)生誤解。采用熒光激活細(xì)胞分選法或共軛磁珠輔助法可以基于細(xì)胞膜表面蛋白與靶細(xì)胞群體進(jìn)行分選悔详。雖然這些方法確實產(chǎn)生了重要的發(fā)現(xiàn)镊屎，但它們是費(fèi)力和昂貴的，并且不能完全識別細(xì)胞異質(zhì)性的完整圖譜茄螃，并留下一些未描述的細(xì)胞亞群缝驳。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的產(chǎn)生實現(xiàn)了從平均到每個細(xì)胞獨(dú)特的Zoom in，能夠揭示細(xì)胞群的異質(zhì)性與新的細(xì)胞狀態(tài)以及闡述細(xì)胞分化與發(fā)育中的動態(tài)轉(zhuǎn)變归苍，對于心血管疾病的研究具有重要作用用狱。

接著，作者介紹了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在細(xì)胞水平中的具體應(yīng)用拼弃。器官圖譜的產(chǎn)生對于器官特定功能的了解具有重要作用夏伊。由于scRNA-seq能夠交叉分析給定樣本中多種細(xì)胞類型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，因此也可以根據(jù)基因表達(dá)預(yù)測通過配體-受體結(jié)合的細(xì)胞間通訊吻氧。這些類型的分析預(yù)計將進(jìn)一步補(bǔ)充空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的進(jìn)展溺忧。重要的是，單細(xì)胞基因組學(xué)盯孙、轉(zhuǎn)錄組學(xué)鲁森、表觀基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)合將是評估細(xì)胞群體異質(zhì)性及其對患者特異性藥物反應(yīng)和不良反應(yīng)的貢獻(xiàn)的關(guān)鍵。

在本篇綜述中振惰，研究人員探討了scRNA-seq的實驗流程和應(yīng)用歌溉，討論了相關(guān)的數(shù)據(jù)分析策略，并總結(jié)了心血管研究中使用scRNA-seq發(fā)表的研究成果骑晶。此外研底，我們還描述了整合多模式單細(xì)胞組學(xué)平臺的潛力，這有望提高我們探尋心血管領(lǐng)域知識缺口的能力透罢，并加速精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的進(jìn)步榜晦。

結(jié)果

單細(xì)胞RNA測序技術(shù)

在過去的10年里，各種單細(xì)胞方法已經(jīng)發(fā)展起來羽圃，它們有不同的方法來捕獲和擴(kuò)增細(xì)胞乾胶，以及mRNA轉(zhuǎn)錄長度、捕獲的靶細(xì)胞數(shù)量和每個細(xì)胞讀取深度的差異朽寞。每種方法各有優(yōu)缺點识窿，但是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析有一套共有流程。

單細(xì)胞制備的主要挑戰(zhàn)包括起始樣品的脆弱性脑融、物理壓力喻频、緩沖液的選擇、細(xì)胞解離時間和單細(xì)胞產(chǎn)量肘迎。最小的處理甥温，同時保持樣本完整性和實驗和運(yùn)行之間的標(biāo)準(zhǔn)化是減少數(shù)據(jù)可變性的關(guān)鍵锻煌。操作時間的減少減少了人為錯誤，提高了數(shù)據(jù)的一致性和質(zhì)量姻蚓。對于基于微滴的scRNA-seq宋梧，在捕獲單細(xì)胞之前需要準(zhǔn)備單細(xì)胞的活種群，并且必須消除細(xì)胞聚集或聚集狰挡、死細(xì)胞碎片和自由漂浮的mRNA捂龄。

質(zhì)控與均一化

當(dāng)單細(xì)胞捕獲、文庫準(zhǔn)備和測序完成后加叁，讀取比對可以應(yīng)用于原始測序數(shù)據(jù)倦沧，使用通用RNA-seq讀取比對器STAR，利用公共平臺(如10x Genomics的Cell Ranger)生成特征條形碼矩陣它匕。Cell Ranger也可以過濾和計數(shù)條形碼和獨(dú)特的分子識別器以及標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)從多個實驗達(dá)到相同的測序深度展融。其他預(yù)處理管道，如dropEst超凳、Dr.seq2和scPipe愈污，也可用于生成表達(dá)矩陣∫現(xiàn)有的用于Bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的工具轮傍，如FastQC或RNA-SeQC，可以用于處理scRNA-seq數(shù)據(jù)首装。詳細(xì)的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化方法以前已經(jīng)發(fā)表過创夜。

比對后，可以使用大量的R包或python包進(jìn)行數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制仙逻、可視化和分析驰吓。迄今為止，Monocle39系奉、Scanpy40檬贰、Scater41、Scell42缺亮、Seurat43和sina44軟件包是用戶驅(qū)動的翁涤、無監(jiān)督的單細(xì)胞基因表達(dá)分析最常用的軟件包。使用Seurat萌踱，各種質(zhì)量控制參數(shù)葵礼，如線粒體基因百分比，總基因計數(shù)和每個細(xì)胞的唯一分子標(biāo)識數(shù)并鸵，可以被可視化鸳粉。為下游分析這些參數(shù)的閾值。值得注意的是园担，與所有其他細(xì)胞類型(5-20%)相比届谈，心肌細(xì)胞具有異常高的線粒體基因含量(占總轉(zhuǎn)錄本的58 -86%)枯夜。

降維

scRNA-seq數(shù)據(jù)的多維特性，即單維表示單個基因的表達(dá)疼约，必須降低其可解釋的可視化和分析卤档。到目前為止，各種各樣的降維算法和無監(jiān)督聚類已經(jīng)被開發(fā)出來程剥。在為感興趣的數(shù)據(jù)集選擇最優(yōu)算法時劝枣，必須考慮計算和生物學(xué)上的優(yōu)缺點，因為沒有一種單一的方法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)织鲸。關(guān)于不同算法的差異和具體性質(zhì)的更多細(xì)節(jié)已經(jīng)在之前發(fā)表過舔腾。

隨著基于液滴的scRNA-seq的出現(xiàn)，數(shù)據(jù)集的大小越來越大搂擦，現(xiàn)在產(chǎn)生了更多的細(xì)胞捕獲稳诚，提供更大的能力并提高了識別罕見細(xì)胞群的能力。此外瀑踢，線性變換扳还，如主成分分析(PCA)，由于高水平的dropout和噪音46橱夭，不能捕捉細(xì)胞關(guān)系氨距。非線性降維算法，如t分布隨機(jī)鄰居嵌入(t-SNE)47和一致流形近似和投影(UMAP)48棘劣，由于其靈活性和生成可視可解釋結(jié)果的能力俏让，因此變得越來越受歡迎。

因此茬暇，公開可用的包可允許從用戶定義的PCAs從t-SNE和UMAP進(jìn)行投射和可視化首昔。非線性降維的分辨率，即k-means值（由大往小調(diào)糙俗，先細(xì)分群勒奇，再粗分群），可由用戶設(shè)置和調(diào)整巧骚。單個的k-means值或分辨率與產(chǎn)生的簇的數(shù)量直接相關(guān)赊颠，不可能是完全正確的，這需要研究者從生物學(xué)和生理學(xué)的角度來驗證從選擇的分辨率得到的簇的數(shù)量和類型是否確實有效网缝。

數(shù)據(jù)分析

未監(jiān)督細(xì)胞群分類：與傳統(tǒng)的bulk分析相比巨税，scRNA-seq的一個顯著優(yōu)勢是識別和描述給定樣本中存在的異質(zhì)細(xì)胞群。從生物學(xué)角度來看粉臊，心臟中的細(xì)胞群代表不同的細(xì)胞類型草添，如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞扼仲、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞远寸，但它們也可以代表相同細(xì)胞類型的不同功能狀態(tài)抄淑，如心室、心房或起搏器心肌細(xì)胞驰后，或血管生成細(xì)胞與靜止內(nèi)皮細(xì)胞肆资。因此，非監(jiān)督的聚類方法必須執(zhí)行來定義細(xì)胞群灶芝，并以經(jīng)驗來確認(rèn)由數(shù)學(xué)聚類定義的細(xì)胞群是否確實代表生物學(xué)上相關(guān)的或正確的細(xì)胞類型或狀態(tài)郑原。

在單細(xì)胞研究中，監(jiān)督聚類指的是機(jī)器學(xué)習(xí)方法夜涕，它指示一個細(xì)胞是否屬于基于典型的細(xì)胞-簇對的聚類犯犁。例如，MetaNeighbor允許用戶評估細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄特征如何在獨(dú)立的數(shù)據(jù)集上重復(fù)49女器。相反地酸役，無監(jiān)督聚類是涉及到數(shù)據(jù)本身的結(jié)構(gòu)的機(jī)器學(xué)習(xí)，而不需要其他數(shù)據(jù)集的任何干預(yù)驾胆。

許多基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法的聚類策略已經(jīng)建立起來50涣澡。一種流行的策略是k-means方法，它迭代地確定每個細(xì)胞被分配到的最近的k簇中心丧诺。這種策略是無監(jiān)督聚類的一個例子入桂，因為聚類的數(shù)量k是一個由用戶任意定義的參數(shù)，而不是從以前的任何數(shù)據(jù)集學(xué)習(xí)到的锅必。該方法一般是在特征選擇和降維后使用事格，不需要很大的計算能力惕艳。k-means方法的主要缺點是搞隐，它假設(shè)一個預(yù)定數(shù)量的圓形，同樣大小的集群远搪，這當(dāng)違反時劣纲，會導(dǎo)致無法檢測到可能的稀有細(xì)胞群。

另一種廣泛使用的方法是分層聚類谁鳍，它將單個細(xì)胞組合成更大的聚類或者把群分成更小的亞群癞季。該策略包括使用歐幾里得距離等測量值計算單元之間的距離。層次聚類方法比k均值慢倘潜，但允許識別不同粒度的聚類之間的關(guān)系绷柒。層次聚類方法包括通過imputation（歸責(zé)）和dimensionality（維度）、pcaReduce52和sincere進(jìn)行聚類涮因。

圖聚類是第三種方法废睦，涉及基于社區(qū)檢測的算法，廣泛用于分析更大的數(shù)據(jù)集养泡。社區(qū)檢測方法的優(yōu)勢在于它可以擴(kuò)展到數(shù)百萬個細(xì)胞嗜湃。Louvain算法是目前最流行的用于scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的社區(qū)檢測算法之一46奈应。這種方法首先將每個獨(dú)立的單元作為獨(dú)立的集群處理，然后以逐步的方式執(zhí)行模塊化優(yōu)化购披。對于每個單元杖挣，算法檢查是否可以通過將該單元從當(dāng)前的集群移動到另一個集群來增加網(wǎng)絡(luò)模塊化。隨后刚陡，屬于同一簇的細(xì)胞被聚集為超級細(xì)胞形成一個新的網(wǎng)絡(luò)惩妇。迭代地重復(fù)這兩個步驟，直到不能進(jìn)一步增加模塊化為止筐乳。利用PhenoGraph53和Seurat43方法可以實現(xiàn)Louvain算法屿附。其他獨(dú)立的無監(jiān)督聚類方法包括貝葉斯信息準(zhǔn)則和Akaike信息準(zhǔn)則，它們可以用來估計最優(yōu)的聚類數(shù)量54哥童。

譜系重建

細(xì)胞軌跡分析工具使細(xì)胞譜系的時間順序或生物的種群在開發(fā)過程中從多個時間點的細(xì)胞或干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化擬時間的概念,一個標(biāo)量測量細(xì)胞的長時間在無監(jiān)督manner55鋪平了道路挺份。在過去的5 - 6年里，基于降維贮懈、最近鄰圖匀泊、簇網(wǎng)絡(luò)和RNA速度的四種主要的譜系重建算法被開發(fā)出來。每一種方法的計算和生物學(xué)細(xì)節(jié)朵你，以及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和遺傳譜系追蹤的結(jié)合如何促進(jìn)我們對發(fā)育各聘、組織穩(wěn)態(tài)和疾病的理解，之前已經(jīng)描述過56抡医。譜系重建工具在描述冠狀動脈發(fā)育57躲因、第一和第二心臟場祖細(xì)胞規(guī)范58以及涉及人類心臟發(fā)育的所有主要細(xì)胞類型的基因表達(dá)變化方面特別有用。

在過去的一年中,譜系追蹤超出基于表達(dá)的計算重建已經(jīng)成為可能,通過跟蹤體細(xì)胞突變線粒體DNA (mtDNA),使用scRNA-seq或類似的方法來評估染色質(zhì)易訪問性如單細(xì)胞分析轉(zhuǎn)錄酶可及性染色質(zhì)使用測序（scATAC-seq) 忌傻。mtDNA的突變率通常比核DNA高10- 100倍大脉，許多研究人員利用這一差異證明，mtDNA突變的積累可以作為內(nèi)源性遺傳條形碼水孩，在體外和體內(nèi)追蹤細(xì)胞譜系镰矿。mtDNA序列變化已被跟蹤，以重建造血細(xì)胞和實體瘤的克隆混合物中的細(xì)胞關(guān)系俘种。與核基因組測序相比秤标，這種方法使克隆追蹤規(guī)模增加了1000倍。一種基于scATAC-seq(內(nèi)源性突變的表觀基因組和線粒體條形碼譜系宙刘，或徽章)形成的類似方法同時被開發(fā)出來苍姜，以促進(jìn)急性髓系白血病患者造血干細(xì)胞及其后代的克隆進(jìn)化分析60。這些單細(xì)胞方法補(bǔ)充了現(xiàn)有的遺傳譜系追蹤技術(shù)悬包，并將克隆追蹤研究擴(kuò)展到任何真核生物的任何細(xì)胞或組織類型衙猪，包括人類心血管組織。

細(xì)胞內(nèi)相互作用的預(yù)測

使用傳統(tǒng)的Bulk分析工具幾乎不可能在不同的細(xì)胞和組織類型之間分析和解釋旁分泌信號通路。分析scRNA-seq數(shù)據(jù)的信息學(xué)工具的發(fā)展提供了研究細(xì)胞間通信和信號傳遞的一個有前途的解決方案屈嗤。例如潘拨，在現(xiàn)有的人類數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，已經(jīng)建立了一份2000對小鼠配體受體對的清單饶号，用于分析成年小鼠心臟每種細(xì)胞類型中配體受體對的表達(dá)模式铁追。令人驚訝的是，分析顯示在非心肌細(xì)胞群體中存在著密集的通訊網(wǎng)絡(luò);心臟成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是最有營養(yǎng)的細(xì)胞群茫船，具有密切的多細(xì)胞連接琅束，支持特定的鄰近細(xì)胞群的生存。在胎鼠心臟中算谈，通過細(xì)胞間通訊分析涩禀，確定心外分泌和心內(nèi)膜分泌的旁分泌因子，這些因子在心臟形成過程中調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖和小梁向致密心肌的過渡然眼。內(nèi)皮細(xì)胞分化的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)的scRNA-seq同樣揭示了分化過程中產(chǎn)生的多種細(xì)胞類型之間廣泛的細(xì)胞間相互作用和分子間的相互作用艾船。然而，這些相互作用網(wǎng)絡(luò)并沒有考慮細(xì)胞類型的實際解剖位置或邊界高每，也沒有提供細(xì)胞串?dāng)_的確切證據(jù)（缺點）屿岂。應(yīng)對相應(yīng)的生物樣品進(jìn)行足夠的體內(nèi)或體外實驗，包括但不限于FACS鲸匿、免疫組化爷怀、原位雜交或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，以驗證生信細(xì)胞類型鑒定和配體受體對預(yù)測分析带欢。然而运授，上述工具對于大規(guī)模、無監(jiān)督地預(yù)測異質(zhì)細(xì)胞群中的多細(xì)胞信號通路是非常強(qiáng)大的乔煞。因此吁朦，使用scRNA-seq的細(xì)胞間通信預(yù)測分析可以補(bǔ)充各種正交方法(如蛋白質(zhì)組學(xué))和成像模式，以發(fā)現(xiàn)和闡明細(xì)胞串話的新機(jī)制瘤缩。

[if !supportLists]2.?[endif]生成心血管細(xì)胞圖譜

心臟發(fā)育

scRNA-seq已被用于廣泛的心血管系統(tǒng)組織和細(xì)胞類型(表2)喇完。2016年伦泥，兩組研究人員通過對胚胎心臟解剖定義區(qū)域的分析剥啤，獨(dú)立生成了所有主要心臟細(xì)胞類型在不同發(fā)育階段的單細(xì)胞圖。Li等人使用隨機(jī)森林算法分析了小鼠在胚胎期第8.5天(E8.5)至第10.5天的心臟轉(zhuǎn)錄譜不脯，并能夠以91%的準(zhǔn)確性預(yù)測個體心肌細(xì)胞在發(fā)育過程中的解剖位置府怯，包括以胰島1標(biāo)記的譜系追蹤細(xì)胞(Isl1;也被稱為胰島素基因增強(qiáng)蛋白(Isl1)，它存在于流出道和右心室64防楷。del發(fā)笑等人采用了類似的方法牺丙，分析從E9.5至出生后第21天的心臟細(xì)胞，以揭示胚胎和出生后成熟過程中階段特異性心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄程序。這兩項研究都發(fā)現(xiàn)冲簿，同源框蛋白Nkx-2.5的缺陷導(dǎo)致心肌細(xì)胞成熟的嚴(yán)重缺陷粟判，并描述了發(fā)育中的胚胎中已知的心肌細(xì)胞類型的大量異質(zhì)性。

scRNA-seq也被證明對鑒定調(diào)節(jié)形成心臟的早期心臟譜系的出現(xiàn)和分離的機(jī)制非常有用峦剔。例如档礁，小鼠野生型和Mesp1陰性的心血管祖細(xì)胞(CPCs)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析表明，Mesp1是祖細(xì)胞從多能性退出和早期胃腸期誘導(dǎo)心臟基因表達(dá)程序所必需的66吝沫。不同的Mesp1 CPC群體被發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于產(chǎn)生不同心臟譜系和解剖區(qū)域的祖細(xì)胞呻澜，并且在早期心臟發(fā)生過程中識別出與譜系承諾和多樣化相關(guān)的關(guān)鍵分子指紋，正如之前通過Cre loxp介導(dǎo)的譜系追蹤研究所顯示的那樣惨险。在心臟命運(yùn)決定的早期階段羹幸，Nkx2 5+/和Isl1+/+ CPCs的scRNA-seq也導(dǎo)致了之前未知的祖細(xì)胞亞群的鑒定。發(fā)育軌跡分析還表明辫愉，Nkx2-5的長時間表達(dá)使CPCs走向單向心肌細(xì)胞命運(yùn)栅受，而Isl1+/+ CPCs在分化成多個發(fā)育分支之前通過一個吸引狀態(tài)。同樣,從Nkx2-5和Isl1 lineage-tracing胚胎老鼠心臟細(xì)胞分離進(jìn)行 scRNA-seq評估了第一和第二心臟區(qū)域的祖細(xì)胞分化識別了兩個祖細(xì)胞類型不同的分化動力學(xué)并揭示了CPCs和終末分化心血管細(xì)胞之間的溝通恭朗。同樣窘疮，對被囊動物心咽發(fā)育的scRNA-seq分析揭示了第一和第二心臟譜系中不同的分子信號通路〖侥基于網(wǎng)絡(luò)的計算方法也被用于預(yù)測譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子闸衫，Hand2被確定為流出道細(xì)胞而不是右心室細(xì)胞存在的標(biāo)記物70。有趣的是诽嘉，Hand2-null小鼠胚胎的右心室沒有正常形成蔚出，隨后的scRNA-seq分析表明流出道心肌規(guī)格的失敗，而不是右心室心肌規(guī)格的失敗虫腋，是先天性心臟缺陷表型的原因骄酗。這些發(fā)現(xiàn)表明，在單細(xì)胞水平上了解先天性心臟病的致病機(jī)制悦冀，對于準(zhǔn)確定義和定位構(gòu)成該疾病表型表現(xiàn)的細(xì)胞亞群至關(guān)重要趋翻。此外，單細(xì)胞測序的未來應(yīng)用將有助于確定獨(dú)特的患者特異性病因盒蟆，這些病因可能在病理生物學(xué)上有所不同踏烙，因為不同的細(xì)胞異質(zhì)性和基因表達(dá)模式會導(dǎo)致共同的疾病表型。

成年心臟穩(wěn)態(tài)與疾病

除了胚胎和出生后的心臟外历等，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)還被用于描述成年小鼠心臟的細(xì)胞亞群讨惩。通過對未受傷的成年小鼠心臟的非心肌細(xì)胞的scRNA-seq，在內(nèi)皮細(xì)胞寒屯、心臟成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間發(fā)現(xiàn)了一個廣泛的細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)荐捻，這可能參與維持心臟穩(wěn)態(tài)61黍少。此外，心肌細(xì)胞基因表達(dá)的類型特異性和性別特異性差異也可能參與心臟穩(wěn)態(tài)和重構(gòu)处面。出生后小鼠心臟的單核RNA測序發(fā)現(xiàn)了兒童線粒體心肌病小鼠模型的細(xì)胞類型特異性缺陷34厂置。此外，使用SORT測序方法對穩(wěn)態(tài)條件下和缺血損傷后的成人心臟進(jìn)行分析魂角，發(fā)現(xiàn)在已知細(xì)胞類型內(nèi)存在多個亞群农渊。成年小鼠心臟中的所有細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞或颊，使用FACS通過直徑為130 m的大噴嘴分離;使用高前向散射寬度可以豐富地分離出形狀不規(guī)則的成年心肌細(xì)胞砸紊，這一點通過tdTomato報告系譜追蹤方法得到證實。兩個獨(dú)立的組能夠通過無Langendorff酶解心室組織獲得存活的成年心肌細(xì)胞21,72囱挑，然而另一個研究小組報告醉顽，如果不使用Langendorff儀器，分離存活的和未破碎的心室心肌細(xì)胞很困難72平挑。Gladka等證明缺血再灌注觸發(fā)在各種細(xì)胞類型中出現(xiàn)了以前未知的細(xì)胞亞群游添，并發(fā)現(xiàn)活化成纖維細(xì)胞中Ckap4的增加。使用Langendorff灌注和基于塊的方法73分別分離小鼠和人類心室通熄，Nomura等人在Smart-seq2平臺上對成年心肌細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq唆涝，在單細(xì)胞水平上識別肥厚心肌細(xì)胞的基因模塊。值得注意的是,Monocle-based cellular-trajectory分析小鼠心肌細(xì)胞在不同時間點的,經(jīng)歷了TAC顯示p53 myocyte-specific增強(qiáng)劑的重要作用因素2核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞兩個相關(guān)因子2信號軸促進(jìn)DNA氧化損傷后心肌細(xì)胞肥厚亞群的致病基因的激活唇辨。這些發(fā)現(xiàn)被來自心力衰竭患者心肌細(xì)胞的scRNA-seq獲得的數(shù)據(jù)證實74廊酣。scRNA-seq 冰凍損傷斑馬魚心臟的心肌細(xì)胞邊界地帶顯示邊界地帶損傷后的心肌細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組像胚胎心肌細(xì)胞,能夠解釋在斑馬魚心臟再生引起心肌細(xì)胞皮質(zhì)骨小梁和皮質(zhì)細(xì)胞類型過程中觀察到的小梁心肌細(xì)胞向皮層心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。

為了研究心肌梗死(MI)后新生血管中內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性赏枚，Li等人對從內(nèi)皮特異性譜系中分離出來的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了基于液滴的scRNA-seq亡驰，在基線和MI后7天追蹤小鼠心臟。在PCA鑒定的10個內(nèi)皮細(xì)胞群中饿幅，與對照組相比凡辱，心肌梗死后5個內(nèi)皮細(xì)胞群顯著富集于心臟，同時與心臟重塑栗恩、內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)相互作用透乾、增殖和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因上調(diào)。質(zhì)膜囊泡相關(guān)蛋白(Plvap)在MI后的小鼠心肌模型和人類心臟的5個集群中的3個高表達(dá)磕秤。有趣的是乳乌，Plvap表達(dá)的增加定位于梗死邊緣區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞，一種與MI后促進(jìn)內(nèi)源性心臟組織修復(fù)的生長因子定位共享的分子模式亲澡。心肌梗死后7天對心臟成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞的類似分析揭示了這些非心肌細(xì)胞群的動態(tài)通量钦扭，每一種細(xì)胞都有自己的中間過渡狀態(tài)和獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征。

綜上所述床绪，越來越多的研究已經(jīng)使用scRNA-seq來闡明心肌梗死后各種非心肌細(xì)胞群的作用，提高了我們對缺血組織重塑過程中微環(huán)境變化的理解。未來的研究將受益于對這些細(xì)胞類型和過渡狀態(tài)的具體功能的更深入的機(jī)制研究癞己，特別是在損傷后的不同階段膀斋，如早期急性炎癥(心肌梗死后1天)和晚期重塑(心肌梗死后30天)。這樣的研究將有助于更好地描述病理心肌纖維化過程中內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的動力學(xué)或間葉細(xì)胞到內(nèi)皮細(xì)胞的過渡在心血管生成的期間”匝牛現(xiàn)在,轉(zhuǎn)錄組調(diào)查和后續(xù)的細(xì)胞間相互作用的驗證在non-cardiomyocyte細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間的溝通在組織修復(fù)和重塑過程中還沒有被充分研究,并填補(bǔ)這些我們在知識方面的缺口有利于改善我們對不同階段參與心臟損傷和修復(fù)的細(xì)胞反應(yīng)的理解仰担。

scRNA-seq也被用于描述人類胚胎心肌細(xì)胞的基因表達(dá)狀況12。通過單細(xì)胞標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄測序绩社，從18個人類胚胎(妊娠5至25周)中提取了大約4000個解剖定義的心臟細(xì)胞摔蓝，以繪制出人類心臟的發(fā)育軌跡。四種主要的心肌細(xì)胞類型(心肌細(xì)胞愉耙、內(nèi)皮細(xì)胞贮尉、成纖維細(xì)胞和瓣膜間質(zhì)細(xì)胞)被鑒定出來，心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在發(fā)育過程中都經(jīng)歷了基因表達(dá)的逐步變化12朴沿。重要的是猜谚，人類和小鼠心臟之間的比較分析揭示了人類心臟發(fā)育的幾個獨(dú)特特征，表明存在種間差異赌渣，這些差異可能在bulk分析中不明顯魏铅，但可能在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平上可以辨別出來。Cui等人比較了小鼠和人類scRNA-seq數(shù)據(jù)集中發(fā)育中的心臟中的四種主要細(xì)胞類型(心肌細(xì)胞坚芜、內(nèi)皮細(xì)胞览芳、成纖維細(xì)胞和心外膜細(xì)胞)，并報告稱鸿竖，在研究的細(xì)胞類型中路操，來自人類和小鼠的心肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上最相似12。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析顯示,心肌細(xì)胞在小鼠和人類7周E10.5最為相似,而5-week-old從人類最類似成纖維細(xì)胞在小鼠E9.5,指示異步小鼠與人類之間的時間軸在心臟細(xì)胞的分化和成熟發(fā)展千贯。此外屯仗，RNASE1在人內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，在人成纖維細(xì)胞中特異性表達(dá)THY1搔谴，在人心外膜細(xì)胞中特異性表達(dá)CFB和ITLN1魁袜，所有這些都在小鼠心臟中低水平表達(dá)。相比之下敦第，Icam2在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)峰弹，Rnf213在小鼠心外膜細(xì)胞中特異性表達(dá)，突出了不同細(xì)胞類型基因表達(dá)譜的種間相似性和差異芜果。目前正在努力生成大規(guī)模的鞠呈、單個的人類成年心臟圖譜，特別是使用心肌細(xì)胞的單核RNA-seq和非心肌細(xì)胞的scRNA-seq?82右钾∫狭撸總之旱爆，這些研究證明了scRNA-seq在深入了解細(xì)胞間變異和確定心臟發(fā)育和疾病中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄程序方面的效用。

血管和造血細(xì)胞

冠狀血管的形成是一個高度動態(tài)窘茁、有序的發(fā)育過程怀伦。盡管動脈和靜脈的發(fā)育受相互拮抗的轉(zhuǎn)錄程序控制，但在發(fā)育和再生過程中山林，預(yù)先存在的靜脈往往通過未知的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換產(chǎn)生新動脈房待。scRNA-seq技術(shù)在闡明血管發(fā)育過程中細(xì)胞的動態(tài)轉(zhuǎn)變方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。例如驼抹，將scRNA-seq與譜系追蹤轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)合發(fā)現(xiàn)桑孩，冠狀動脈是由發(fā)育過程中由靜脈細(xì)胞衍生的特定前動脈群體形成的57。研究發(fā)現(xiàn)框冀，靜脈細(xì)胞逐漸從靜脈表型轉(zhuǎn)變?yōu)閯用}表型流椒，直到細(xì)胞亞群克服轉(zhuǎn)錄閾值轉(zhuǎn)變?yōu)閯用}前狀態(tài)。靜脈特異性轉(zhuǎn)錄因子政變轉(zhuǎn)錄因子2 (COUP- tf2)被認(rèn)為是這一命運(yùn)開關(guān)的關(guān)鍵中介左驾，為靜脈源性動脈形成的機(jī)制提供了分子視角镣隶。健康成年小鼠的主動脈單細(xì)胞圖譜識別了所有的主動脈細(xì)胞類型及其亞群85，幼齡(8周)和老年(18個月)小鼠的主動脈對比顯示內(nèi)皮細(xì)胞群的轉(zhuǎn)錄組差異很大诡右。

scRNA-seq也被用于描述主要血管疾病中的細(xì)胞狀態(tài)和命運(yùn)決定安岂。動脈粥樣硬化動脈是由多種細(xì)胞組成的，包括內(nèi)皮細(xì)胞帆吻、血管平滑肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞域那，這些細(xì)胞對細(xì)胞外細(xì)胞的可塑性和敏感性各不相同。特別是猜煮，盡管VSMCs是一種終末分化的細(xì)胞類型次员，但眾所周知其可塑性很強(qiáng)，使用單細(xì)胞分析有助于描繪VSMCs的細(xì)胞表型調(diào)節(jié)為一種獨(dú)特的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞類型(稱為纖維細(xì)胞)91王带。此外淑蔚，單細(xì)胞分析有助于識別指導(dǎo)人類動脈粥樣硬化血管中VSMC分化狀態(tài)的特定組蛋白變體92。動脈粥樣硬化的典型特征是大量的免疫細(xì)胞愕撰，包括一些巨噬細(xì)胞亞群刹衫，它們的功能和表型特征較差，部分原因是標(biāo)記物數(shù)量有限搞挣。為此带迟，應(yīng)用涉及健康和動脈粥樣硬化主動脈巨噬細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)的非監(jiān)督聚類分析，可以與健康對照組相比囱桨，識別富集于病變主動脈的髓系亞群93仓犬。這些亞群包括單核細(xì)胞、單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞和兩個巨噬細(xì)胞群舍肠，這些巨噬細(xì)胞富含炎癥分子搀继，激活髓系細(xì)胞2 (TREM2)和IL-1β表達(dá)的觸發(fā)受體窘面，幾乎只在動脈粥樣硬化主動脈中可見。類似地律歼，單細(xì)胞分析方法與大規(guī)模細(xì)胞測定術(shù)(CyTOF)結(jié)合使用民镜，在小鼠動脈粥樣硬化斑塊中生成更廣泛的免疫細(xì)胞庫圖譜94衬衬」⒈遥總的來說身堡，在病變的主動脈中發(fā)現(xiàn)了11種不同的白細(xì)胞群，包括三個主要的B細(xì)胞亞群畔况，以及在主動脈白細(xì)胞中富集的幾種細(xì)胞類型特異性通路。重要的是慧库，主動脈白細(xì)胞的組成可以預(yù)測動脈粥樣硬化患者的臨床事件跷跪，這表明單細(xì)胞分析具有翻譯潛力。對6 - 8周齡小鼠降主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的scRNA-seq顯示了三種主要的細(xì)胞群:成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞齐板、有間充質(zhì)特征的內(nèi)皮細(xì)胞和有炎癥特征的內(nèi)皮細(xì)胞吵瞻。

器官圖譜

除了對特定組織或器官系統(tǒng)進(jìn)行鑒定外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析也在更大范圍內(nèi)進(jìn)行甘磨，以建立各種主要器官的全面細(xì)胞圖譜6,7橡羞。使用組合索引法，在妊娠第9.5天13.5天济舆，從61只小鼠胚胎中的200萬個細(xì)胞中生成了小鼠器官發(fā)生細(xì)胞圖譜卿泽，允許可視化所有類型細(xì)胞的發(fā)育軌跡96。一份名為Tabula Muris的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)匯編滋觉，涉及來自20個不同成年小鼠器官和組織的10萬個細(xì)胞签夭，也使用基于流式細(xì)胞儀和基于液滴的scRNA-seq方法生成6。該數(shù)據(jù)集對于確定細(xì)胞類型的基因表達(dá)差異特別有用椎侠，這些細(xì)胞類型存在于許多組織中第租，如內(nèi)皮細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞和組織常駐免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)我纪。基因表達(dá)指紋和獨(dú)特的表面標(biāo)記蛋白的鑒定可以提高這些細(xì)胞的分離和鑒定慎宾，為新的靶向治療打開大門。該Tabula Muris概要是公開可用的宣羊，允許所有領(lǐng)域的研究人員不僅使用它作為一個生物學(xué)參考璧诵，而且進(jìn)一步貢獻(xiàn)其更詳細(xì)的分析〕鸱耄基于組合索引(sci-ATAC-seq)構(gòu)建了一個類似的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性圖譜之宿，以評估13個不同的成年小鼠組織。sci-ATAC-seq數(shù)據(jù)與前面提到的scRNA-seq圖譜的配對揭示了大多數(shù)重疊器官的細(xì)胞類型分配的顯著一致性苛坚，盡管有些在肺和大腦中發(fā)現(xiàn)了差異比被。但這些綜合方法為闡明不同組織和細(xì)胞類型的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜機(jī)制提供了廣闊的前景色难。多機(jī)構(gòu)聯(lián)盟已經(jīng)形成,目前正產(chǎn)生人類細(xì)胞地圖冊,包括人類細(xì)胞Atlas consortium97陳扎克伯格倡議和人類生物分子圖譜計劃(HuBMAP) 98年由美國國立衛(wèi)生研究院,這將使變化的表征,在成人心臟內(nèi)的所有細(xì)胞類型在自然老化和應(yīng)對疾病(圖4)。最后,公開訪問的數(shù)據(jù)庫scRNA-seq研究,如PanglaoDB99等缀、scRNASeqDB和SingleCell Portal可以在線獲得枷莉，其中scRNA-seq數(shù)據(jù)集可以根據(jù)原始組織或細(xì)胞類型進(jìn)行分類和識別，包括人類和小鼠的心臟尺迂、血管和iPSC衍生物笤妙。

多能干細(xì)胞模型

人類iPSC模型已被證明在患者特異性疾病建模和再生治療中有用，但主要的挑戰(zhàn)噪裕，包括iPSC來源的心血管細(xì)胞的不成熟和未解決的異質(zhì)性蹲盘，仍然存在。因此,許多研究利用scRNA-seq確定了參與分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號通路,識別引起的所有細(xì)胞分化類型,和優(yōu)化和修改方案去生成專門的心臟和血管細(xì)胞亞型(表3)膳音。

利用現(xiàn)有方法生成的人類ipsc衍生心肌細(xì)胞(iPSC-CMs)在形態(tài)召衔、大小、電生理特性祭陷、鈣處理苍凛、收縮性和代謝功能方面具有胎兒般的特征。Friedman等人對處于iPSC-CM分化不同階段的40000個細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq兵志，并報道了非dna結(jié)合同源結(jié)構(gòu)域蛋白HOPX的失調(diào)導(dǎo)致iPSC-CMs的持續(xù)不成熟狀態(tài)醇蝴。在另一項研究中，從多余10,000個細(xì)胞基于液滴的scRNA-seq中鑒定出iPSC-CM分化過程中的心臟轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子;iPSC-CMs表達(dá)COUP-TF2和T-box轉(zhuǎn)錄因子TBX5更為成熟和心房樣形象,而與YRPW毛/ enhancer-of-split相關(guān)主題的表達(dá)蛋白2 (HEY2) iroquois-class homeodomain蛋白質(zhì)IRX4和肌球蛋白輕鏈2,心室/心肌同種型(MYL2)富含心室樣 iPSC-CMs毒姨。通過對等基因iPSC系的基因組編輯哑蔫，證實轉(zhuǎn)錄因子NR2F2和HEY2分別在形成類心房、類心室的iPSC- cms電生理和基因表達(dá)譜中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用弧呐≌⒚裕總之，這些研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了iPSC-CMs的異質(zhì)性俘枫，并揭示了控制細(xì)胞成熟和特異腔室人iPSC-CMs的特點的心臟轉(zhuǎn)錄因子腥沽。

人ipsc來源的內(nèi)皮細(xì)胞(iPSC-ECs)也已被用于血管疾病建模，并在體外有效地概述遺傳和環(huán)境因素對血管功能障礙的影響鸠蚪。然而今阳，與iPSC-CMs一樣，目前可用的iPSC-ECs受到細(xì)胞不成熟和異質(zhì)性的限制茅信。誘導(dǎo)分化過程中基于液滴的iPSC-ECs的scRNA-seq導(dǎo)致iPSC-ECs的四個主要亞群被富集的基因表達(dá)APLNR盾舌、CLDN5、ESM1和GJA5標(biāo)記;CLDN5+簇代表代謝活躍的iPSC-ECs, GJA5+簇代表動脈樣iPSC-ECs, APLNR+簇代表炎癥反應(yīng)性iPSC-ECs, ESM1+亞群代表活化細(xì)胞蘸鲸。在另一項研究中妖谴，McCracken等人對兩獨(dú)立的人類胚胎干細(xì)胞來源的內(nèi)皮細(xì)胞(ESC-EC)分化方案進(jìn)行了縱向基于液滴的scRNA-seq分析。ESC-EC產(chǎn)品方案擬時間軌跡顯示分化為內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞類型在第6天分化,與接受成熟細(xì)胞類型分化在第八天,以減少表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的SNAI2和增加表達(dá)ANGPT2為特點,ESM1和GNG11在內(nèi)皮細(xì)胞群。盡管在最初的內(nèi)皮細(xì)胞承諾后膝舅，ESC-ECs進(jìn)一步成熟嗡载，但沒有進(jìn)一步的器官特異性內(nèi)皮表型承諾的標(biāo)志物被觀察到。未來的研究應(yīng)側(cè)重于識別器官特異性轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征仍稀，并進(jìn)一步優(yōu)化分化方案去產(chǎn)生解剖定義的多能干細(xì)胞來源的ECs洼滚。

單細(xì)胞多組學(xué)方法

組合索引

目前，scRNA-seq技術(shù)的一個主要局限性是從分離的單細(xì)胞中制備RNA-seq文庫的成本很高技潘。成本隨細(xì)胞加工數(shù)量的增加而線性增加遥巴，這給單個實驗室和多機(jī)構(gòu)聯(lián)盟造成了巨大的障礙。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)崭篡，新的多路復(fù)用方法被開發(fā)出來挪哄，以增加通量吧秕，同時也降低每個單元的成本琉闪。其中一種方法是組合索引，這涉及到使用兩種獨(dú)立但概念相同的方法砸彬，即單細(xì)胞組合索引RNA測序108和基于連接的分裂池轉(zhuǎn)錄組測序109颠毙，在這種方法中，單個細(xì)胞或細(xì)胞核被分離砂碉、貼條形碼蛀蜜、合并，然后再次分裂以獲得額外的條形碼增蹭。與基于液滴或微孔平臺使用的單個條形碼不同滴某，多輪細(xì)胞分裂和條形碼索引能夠?qū)Υ罅繂渭?xì)胞或細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行獨(dú)特的標(biāo)記。這些組合索引策略可以將分析的細(xì)胞數(shù)量增加10倍到1000倍滋迈，而不需要對單個細(xì)胞進(jìn)行物理隔離霎奢。這項技術(shù)的最新迭代可以在一次運(yùn)行中從60個胚胎中提取多達(dá)200萬個細(xì)胞。然而饼灿，盡管在通量上有令人矚目的增長幕侠，組合索引通常產(chǎn)生較淺的測序深度，可能無法識別極其罕見的細(xì)胞群碍彭，這通常是執(zhí)行scRNA-seq分析的主要目標(biāo)（通量-測序深度--識別細(xì)胞群上的區(qū)別）晤硕。因此，這是一種取舍在優(yōu)化實驗設(shè)計和設(shè)置時庇忌，應(yīng)仔細(xì)考慮實驗的廣度和深度舞箍。

組合單細(xì)胞技術(shù)

除了scRNA-seq技術(shù)，還有無數(shù)其他單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)也在開發(fā)或使用中皆疹。這些技術(shù)包括單細(xì)胞染色質(zhì)可及性(如scATAC-seq)疏橄、DNA甲基組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，所有這些技術(shù)都攜帶著獨(dú)特的信息墙基，這些信息不能僅由scRNA-seq完全捕獲软族，即使在其最大深度和通量刷喜。例如，染色質(zhì)組織和可及性的整體或局部變化可以先于主要的轉(zhuǎn)錄事件立砸，在mRNA表達(dá)水平上檢測到它們之前掖疮，并可能代表一個更穩(wěn)定的細(xì)胞表型或狀態(tài)。scATAC-seq已被開發(fā)用于同時探測數(shù)以萬計細(xì)胞的染色質(zhì)可及性譜颗祝，并識別控制轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件浊闪。這項技術(shù)已經(jīng)開始揭示果蠅胚胎發(fā)生(人類造血)以及T細(xì)胞受體特異性的新調(diào)控環(huán)境。scATAC-seq需要考慮的一點是螺戳，它通常需要額外的步驟來物理隔離單個核搁宾，考慮到在多次離心和再懸浮過程中核膜的脆弱性和半通透性，這一過程需要額外的小心倔幼。與scRNA-seq一樣盖腿，根據(jù)感興趣的樣本定制隔離方案對于確保核的完整性和敏感性至關(guān)重要。隨著這些工作流程的持續(xù)優(yōu)化损同，預(yù)計scATAC-seq將改變我們探究表觀基因組調(diào)控機(jī)制的方式翩腐，特別是在分析平行scRNA-seq基因表達(dá)譜時。一項較早的研究表明膏燃，兩種組學(xué)平臺可以通過一種新的基于索引的聯(lián)合分析在算法上或同時集成茂卦。

與染色質(zhì)可及性一樣，dna甲基化景觀也可以為不同細(xì)胞的分化潛能和轉(zhuǎn)錄活性提供獨(dú)特的見解组哩，這些方式可能無法通過RNA表達(dá)反映或推斷出來等龙。各種各樣的策略已被開發(fā)用于單細(xì)胞DNA甲基組分析，其中一些已經(jīng)與scRNA-seq或染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)配對伶贰，以揭示表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的協(xié)調(diào)機(jī)制蛛砰。然而，盡管在整合多組學(xué)數(shù)據(jù)方面取得了進(jìn)展幕袱，但我們對這些調(diào)控過程如何自身分層表現(xiàn)為下游細(xì)胞表型和行為狀態(tài)的理解仍然有限暴备。一個技術(shù)瓶頸似乎是缺乏一種類似的單細(xì)胞方法，可以以類似的靈敏度和通量來詢問細(xì)胞蛋白質(zhì)組们豌。綜合方法允許同時審訊單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組連同成千的蛋白質(zhì)已經(jīng)開發(fā)使用oligonucleotide-conjugated抗體,稱為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的索引和抗原表位進(jìn)行排序(CITE-seq)或TotalSeq,但這些方法目前限于少數(shù)表面蛋白和依賴的可用性專門設(shè)計的抗體涯捻。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)這一新興領(lǐng)域正在不斷努力，以開發(fā)可替代的蛋白質(zhì)檢測方法望迎，以提高靈敏度和范圍(如Edman降解的變化)障癌，改進(jìn)樣品制備管道和改進(jìn)基于質(zhì)譜的平臺。工作流程的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化可能對實現(xiàn)真正的單細(xì)胞分辨率的整體多組學(xué)分析至關(guān)重要辩尊，該分析可以在蛋白質(zhì)水平上連接上游基因調(diào)控機(jī)制和觀察到的下游表型涛浙。

最后,空間轉(zhuǎn)錄組正迅速成為一個強(qiáng)大的技術(shù),提供了一個全新的維度在單細(xì)胞附近解決上述組學(xué)技術(shù)(圖2)。例如,條形碼oligo-dT微陣列幻燈片已經(jīng)成功地用于RNA映射到特定XY-positions在組織切片上解決~ 100μm分辨率 (ref。128)轿亮。一種被稱為玻片測序的新方法是將組織樣本中的RNA轉(zhuǎn)移到覆蓋著已知位置的dna條形碼珠子的表面疮薇，這樣就可以通過測序來確定RNA的空間位置。該方法大大提高了轉(zhuǎn)錄組圖譜的空間分辨率至10 m我注，與細(xì)胞的平均長度大致匹配按咒，為組織的高維結(jié)構(gòu)分析和復(fù)雜的類器官模型提供了廣闊的前景。Asp等人通過整合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)但骨、scRNA-seq和原位測序励七，生成了人類心臟在前三個月發(fā)育的時空圖譜，以創(chuàng)建3D空間細(xì)胞圖譜奔缠。其他組學(xué)技術(shù)的類似方法(如染色質(zhì)可及性的空間映射)也有望在不久的將來出現(xiàn)掠抬，為使用定位坐標(biāo)可追蹤到單細(xì)胞的高維多組學(xué)分析打開大門。心血管精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)

衛(wèi)生保健的主要挑戰(zhàn)之一是患者對治療的反應(yīng)并不一致校哎。目前两波，市場上大約90%的藥物對50%的治療無效。這些病人特異性藥物反應(yīng)的機(jī)制仍然是難以捉摸的贬蛙，與廣泛的遺傳和環(huán)境因素似乎有貢獻(xiàn)雨女。在這些因素中，患者特異性細(xì)胞間的異質(zhì)性被認(rèn)為是個體間藥物反應(yīng)差異的基本因素和驅(qū)動因素阳准，這凸顯了單細(xì)胞技術(shù)在推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療中的日益重要的作用。

scRNA-seq的早期臨床應(yīng)用主要集中在腫瘤馏臭。原發(fā)性腎腫瘤及其肺轉(zhuǎn)移顯示出相當(dāng)大的細(xì)胞異質(zhì)性野蝇，針對兩個獨(dú)立通路的聯(lián)合治療已被證明比單一治療更有效132。與此同時括儒，其他研究表明绕沈，多種非惡性腫瘤相關(guān)細(xì)胞，包括基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞帮寻，在腫瘤進(jìn)展和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用乍狐。毫不奇怪，給定腫瘤組織的細(xì)胞組成因患者不同而有很大差異固逗，這對診斷和治療反應(yīng)有重要意義浅蚪。同樣，心血管疾病的治療也是次優(yōu)的烫罩，因為患者在藥物反應(yīng)方面存在顯著差異135惜傲。例如，來自不同個體的iPSC-CMs的Bulk轉(zhuǎn)錄組分析揭示了人與人之間對常見心血管藥物的細(xì)胞和分子反應(yīng)的差異136,137贝攒。然而盗誊，這些Bulk分析無法檢測可能導(dǎo)致不同藥物反應(yīng)的細(xì)胞異質(zhì)性的個體特異性差異，單細(xì)胞多組學(xué)分析將是揭示這些信息的關(guān)鍵。

由scRNA-seq生成的細(xì)胞圖集顯示哈踱，心臟和周圍血管系統(tǒng)由多種細(xì)胞類型組成荒适，包括心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞开镣、內(nèi)皮細(xì)胞吻贿、血管平滑肌細(xì)胞、瓣膜間質(zhì)細(xì)胞和居民免疫細(xì)胞哑子，每一種細(xì)胞類型都可以進(jìn)一步分為亞型舅列。不同類型的細(xì)胞，特別是非心肌細(xì)胞對心臟發(fā)育卧蜓、內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病的功能貢獻(xiàn)越來越受到重視帐要，這促使近年來對各種心血管疾病中新的細(xì)胞群和亞型的單細(xì)胞研究迅速增加。然而弥奸，與癌癥一樣榨惠，心血管細(xì)胞群的組成和行為在個體之間有很大差異，這可能導(dǎo)致治療反應(yīng)的不一致盛霎。

未來應(yīng)對這些挑戰(zhàn)的一種方法是在臨床干預(yù)之前創(chuàng)建患者特異性細(xì)胞圖譜赠橙。可以想象愤炸，基于scrna序列的細(xì)胞數(shù)量期揪、基因表達(dá)譜和細(xì)胞異質(zhì)性的評估將補(bǔ)充現(xiàn)有的診斷測試，并幫助醫(yī)生確定最有效的规个、個性化的治療方案凤薛。以往使用scRNA-seq發(fā)現(xiàn)的患者血漿生物標(biāo)志物的分析，或者在一些罕見病例中诞仓，通過活組織檢查或間隔肌瘤切除術(shù)獲得的患者心臟樣本的直接分析缤苫，原則上可用于監(jiān)測疾病狀態(tài)和選擇最佳治療時間點。在某些情況下墅拭，異常高數(shù)量的免疫細(xì)胞或升高的細(xì)胞因子表達(dá)可能鼓勵聯(lián)合治療免疫調(diào)節(jié)藥物活玲，以限制干預(yù)后延長炎癥〉瘢考慮到它的高靈敏度舒憾，scRNA-seq也可能在臨床中檢測疾病狀態(tài)下稀有細(xì)胞群體被證明是有用的，那可以更有效地靶向和輸送藥物屡萤。

盡管有這些潛在的好處珍剑，在scRNA-seq可以常規(guī)應(yīng)用于臨床之前，必須克服許多技術(shù)死陆、后勤和資金障礙招拙∵篑考慮到其固有的復(fù)雜性，scRNA-seq作為一種獨(dú)立的治療決策技術(shù)可能是不可行的别凤，而且它將來整合到臨床環(huán)境中很可能需要進(jìn)一步發(fā)展組合分析和并行診斷試驗饰序。此外，實施將需要樣品制備和數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議规哪，以及醫(yī)生友好的界面和軟件求豫。其他重大的財政和后勤考慮可能會阻礙將該技術(shù)立即納入目前的保健系統(tǒng)。然而诉稍，考慮到scRNA-seq技術(shù)在最初幾次迭代中獲得的勢頭蝠嘉，這些挑戰(zhàn)很可能得到解決。隨著scRNA-seq管道的持續(xù)改進(jìn)杯巨、測序成本的降低以及數(shù)據(jù)驅(qū)動的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的進(jìn)步蚤告，轉(zhuǎn)譯單細(xì)胞應(yīng)用將繼續(xù)增長，并很可能重新定義未來患者的治療方式服爷。

結(jié)論

在過去的幾年里杜恰，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已經(jīng)實現(xiàn)了一個巨大的飛躍，從對個體平均群體的研究發(fā)展到對單個細(xì)胞的分析仍源。盡管它的歷史很短心褐，但scRNA-seq已經(jīng)開始推動跨學(xué)科的新發(fā)現(xiàn)，這是傳統(tǒng)的Bulk分析方法不可能實現(xiàn)的笼踩。僅在心血管領(lǐng)域逗爹，scRNA-seq已被許多群體使用，并在識別新細(xì)胞群戳表、闡明譜系軌跡和表征各種發(fā)育和疾病背景下的細(xì)胞間通信方面發(fā)揮了作用桶至。除了使用在細(xì)胞解體特定類型的變化發(fā)展和疾病,scRNA-seq技術(shù)也被用于生成心血管等各種組織的單細(xì)胞圖譜(表2)。這些圖譜形成了可以公開訪問的參考數(shù)據(jù)庫,這可供來自各個領(lǐng)域的研究人員進(jìn)一步分析匾旭。

盡管仍存在一些技術(shù)限制，但隨著實驗和分析管道的不斷改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化圃郊，預(yù)計scRNA-seq在基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用將呈指數(shù)增長价涝。特別是，將scRNA-seq與其他組學(xué)技術(shù)(如單細(xì)胞基因組學(xué)和scATAC-seq)相結(jié)合持舆，目前正在進(jìn)行研究色瘩，有望闡明單細(xì)胞分辨率的基因調(diào)控機(jī)制。將多組學(xué)方法整合到當(dāng)前的工作流程中存在許多挑戰(zhàn)逸寓，但也有望與實驗室和臨床的現(xiàn)有方法相結(jié)合居兆。因此，scRNA-seq技術(shù)不僅有潛力改造基礎(chǔ)科學(xué)竹伸，而且有潛力推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)泥栖。