一句話總結(jié)：利用空間轉(zhuǎn)錄方法在單細(xì)胞分辨率下探索人類心臟發(fā)育的基因表達(dá)圖景，以構(gòu)建一個3D器官范圍的圖譜莫瞬。
Highlights
- Profiled spatiotemporal gene expression patterns in human cardiogenesis
- Mapped cell-type distribution and spatial organization in the human embryonic heart
- Thoroughly analyzed roles of diverse cell types in cardiac development
- A publicly available web resource of the human embryonic heart
人類心臟形態(tài)發(fā)生的過程尚不完全清楚喂江。它的完整特征需要深入單細(xì)胞空間分辨層面探索基因表達(dá)協(xié)調(diào)召锈。在這里，我們提出了一種分子方法开呐，它揭示了胚胎心臟在三個發(fā)育階段的細(xì)胞類型的全面轉(zhuǎn)錄圖譜烟勋，并將特定細(xì)胞類型的基因表達(dá)映射到特定的解剖結(jié)構(gòu)域】鸶叮空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定了獨(dú)特的基因圖譜卵惦，這些基因圖譜對應(yīng)于每個發(fā)育階段的不同解剖區(qū)域。單細(xì)胞RNA測序鑒定的人胚胎心肌細(xì)胞類型證實(shí)并豐富了胚胎心臟基因表達(dá)的空間注釋瓦戚。然后使用原位測序來提煉這些結(jié)果沮尿，并創(chuàng)建三個發(fā)育階段的空間亞細(xì)胞圖。最后较解，我們創(chuàng)建了一個公開可用的人類發(fā)育心臟的網(wǎng)絡(luò)資源畜疾，以促進(jìn)未來對人類心臟發(fā)生的研究。
前言
心臟是人類胚胎中第一個具有功能的實(shí)體器官印衔。它起源于中胚層啡捶，并發(fā)展成心管，在受孕21天左右開始跳動(Sylva et al., 2014; Meilhac and Buckingham, 2018)奸焙。然后心管形成環(huán)狀瞎暑，大約30天后形成四個單獨(dú)的心腔(即左右心房和左右心室)和心外膜。隨后与帆，流出道(OFT)分化了赌，心室肌的外部轉(zhuǎn)變?yōu)橹旅苄募『烷g隔。最終玄糟，OFT分裂成主動脈和肺動脈勿她，大多數(shù)心臟隔室在懷孕前三個月末就完成了。這些復(fù)雜的事件是錯綜復(fù)雜和時空特異性的基因表達(dá)相互作用的結(jié)果阵翎，這些基因表達(dá)相互作用與心臟發(fā)育中的每個部分的空間和功能過程有關(guān)逢并。
單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)的快速發(fā)展使得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜能夠用來探索心臟內(nèi)細(xì)胞的異質(zhì)性，促進(jìn)了我們對心臟分化過程的了解郭卫。例如砍聊，對胚胎(De?Laughter et al., 2016; Li et al., 2016; Lescroart et al., 2018)和成年(Gladka et al., 201)小鼠心臟的研究提供了使用組織勻漿無法獲得的細(xì)胞特異性發(fā)現(xiàn)。此外箱沦，對心肌細(xì)胞空間位置的先驗知識對于揭示胚胎小鼠心臟中特定的腔室基因和不同的時空心肌細(xì)胞群是關(guān)鍵的(DeLaughter et al., 2016; Li et al., 2016)辩恼。然而，小鼠和人類心臟發(fā)育之間存在差異；時間scRNA-seq研究揭示了人類特有的基因在發(fā)育過程中表達(dá)(Cui et al., 2019)灶伊，并且對分化很重要(Sahara et al., 2019)疆前。
轉(zhuǎn)錄組范圍的scRNA-seq研究的一個共同特征是它們不能解決心臟基因表達(dá)的空間模式。因此聘萨，我們需要替代的方法來提供參與這一過程的不同細(xì)胞類型的位置信息竹椒，這對于全面理解發(fā)育動力學(xué)是必要的(Regev et al., 2017)。這些方法可分為靶向方法(Ke et al., 2013; Chen et al., 2015; Wang et al., 2018; Eng et al., 2019)和非靶向方法(Junker et al., 2014; Lee et al., 2014; Lovatt et al., 2014; Sta?hl et al., 2016; Rodriques et al., 2019; Vickovic et al., 2019)米辐。
考慮到人類心臟發(fā)育的復(fù)雜性和不完全理解胸完，我們認(rèn)為建立一種能夠同時分析心臟基因空間表達(dá)模式和細(xì)胞異質(zhì)性的分子方法是很重要的。我們假設(shè)可以利用空間轉(zhuǎn)錄學(xué)(ST)(Sta? hl et al., 2016; Sal?me′ n et al., 2018), scRNA-seq (Zheng et al., 2017)和原位測序 (ISS) (Ke et al., 2013; Qian et al., 2019)開發(fā)出這樣的方法翘贮。ST是一種非靶向技術(shù)赊窥，它使用條形碼寡核苷酸陣列和標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)明場成像來確定組織切片中多聚腺苷酸轉(zhuǎn)錄本的定量空間分布。它生成數(shù)據(jù)驅(qū)動的空間地圖并具有廣泛的適用性(Giacomello et al., 2017; Giacomello and Lundeberg, 2018; Lundmark et al., 2018)狸页。此外锨能，它已被用于分析器官，包括大腦(Sta?hl et al., 2016; Salme′ n et al., 2018)和成年人心臟(Asp et al., 2017)芍耘，以及神經(jīng)變性(Maniatis et al., 2019)址遇。相反，ISS是一種有針對性的方法斋竞，它在組織切片中使用掛鎖探針和滾動圓圈擴(kuò)增來針對已知基因(Ke et al., 2013; Qian et al., 2019)倔约。它便于亞細(xì)胞分辨率的分析，以確認(rèn)基于ST和scRNA-seq的區(qū)域標(biāo)記和細(xì)胞類型識別坝初。
在這里浸剩，我們描繪了一個時空圖譜，它系統(tǒng)地描述了人類心臟在早期三個發(fā)育階段的空間原型和細(xì)胞異質(zhì)性：4.5-5脖卖，6.5和9個受孕后周(PCW)(圖1)乒省。我們通過利用ST的空間探索能力巧颈、scRNA-seq的去卷積能力和ISS的亞細(xì)胞靶向準(zhǔn)確性創(chuàng)建了這個資源畦木。最后，我們通過整合空間信息來可視化我們的結(jié)果砸泛，以生成三維(3D)轉(zhuǎn)錄地圖十籍。
結(jié)果
人類心臟發(fā)育過程中基因的時空動態(tài)表達(dá)
我們最初通過免疫組織化學(xué)(IHC)染色從4.5-5、6.5和9PCW收集的人類胚胎心臟樣本獲得了人類心臟發(fā)育的時空概況(圖2A-2C)唇礁。結(jié)果表明勾栗，左、右心室游離壁和間隔盏筐、左围俘、右心房(TNNT2)在各時間點(diǎn)均由致密的小梁狀心室肌組成。平滑肌肌動蛋白(ACTA2)染色顯示4.5~5PCW心臟主動脈和肺動脈已開始形成，6.5和9個PCW心臟已提前形成主動脈和肺動脈界牡。DAPI(4簿寂，6-二氨基-2-苯基吲哚)染色顯示，在所有三個時間點(diǎn)宿亡，心外膜邊緣都很薄常遂。然而，房室(AV)心外膜下間充質(zhì)(ACTA2)僅在6.5和9PCW時才在房室溝的上端可見挽荠，最后克胳，在心包腔末端，即大動脈進(jìn)入縱隔的地方圈匆，我們觀察到相當(dāng)數(shù)量的帶肺靜脈的縱隔組織(ACTA2)漠另，這只在6.5和9PCW的心臟中才能看到，而ACTA2只在6.5和9PCW的心臟中才能看到跃赚，最后在心包腔的末端酗钞，大動脈進(jìn)入縱隔，我們觀察到相當(dāng)數(shù)量的帶有肺靜脈的縱隔組織(ACTA2)来累，只有在6.5和9PCW的心臟中才能看到ACTA2砚作。總之嘹锁，IHC染色清楚地揭示了人類心臟發(fā)育過程中的時空蛋白表達(dá)模式葫录。然而，分析受到一組預(yù)先選擇的抗體的使用的限制领猾。
為了不偏不倚地擴(kuò)展我們的研究米同，我們使用ST來探索人類心臟發(fā)育過程中的全球時空基因表達(dá)動態(tài)。具體地說摔竿，我們沿著背腹軸分別從4.5-5面粮、6.5和9個PCW心臟組織收集了4、9和6個組織切片(圖S1A继低；表S1A)熬苍。聯(lián)合數(shù)據(jù)集由總共3,115個單獨(dú)的點(diǎn)(即，相當(dāng)于包含以下內(nèi)容的顯微解剖的數(shù)據(jù)點(diǎn))組成袁翁。每個單元30個(圖S1L-S1O)柴底，平均1700個基因和過濾后3,800個唯一的轉(zhuǎn)錄本(圖S1B和S1C)。我們通過確定皮爾遜相關(guān)性來檢查技術(shù)重復(fù)之間的相似性粱胜，發(fā)現(xiàn)所有時間點(diǎn)在基因表達(dá)水平方面都是可比較的(圖S1D-S1G)柄驻。為了研究三個時間點(diǎn)之間的生物學(xué)差異，我們計算了樣本之間的基因表達(dá)相關(guān)性焙压，發(fā)現(xiàn)所有發(fā)育階段的整體基因表達(dá)模式非常相似(圖S1H-S1J)鸿脓。然后抑钟，我們對所有三個階段的聯(lián)合空間(SPOT)基因表達(dá)譜進(jìn)行降維和聚類。我們確定了10個時空保守的簇(圖2D)野哭，并將聚集點(diǎn)映射回其在組織切片中的原始坐標(biāo)味赃。引人注目的是脐帝，這些簇對應(yīng)于所有三個心臟中定義的解剖區(qū)域(圖2E-2G板驳；參見數(shù)據(jù)S1：https://data.mendeley.com/datasets/zkzvyprd5z/draft?a=c3021f62-a7af-4824-b89d-d7fbfec67902)。主要心肌區(qū)域(0回官、1蓉驹、2城榛、3和4簇)在所有時間點(diǎn)上都是共享的，并且似乎反映了心臟的生長态兴，因為這些簇中的斑點(diǎn)數(shù)量隨著年齡的增長而增加(圖S1K)狠持。與其他兩個年齡組相比，4.5-5歲的PCW組織中OFT和較大血管(第5簇)的表達(dá)較低瞻润，主要由房室間充質(zhì)(第6簇)代表喘垂。此外，含有血液和免疫細(xì)胞的空洞(第8簇)僅由6.5個PCW組織中的斑點(diǎn)表示绍撞，該組織比其他兩個心臟含有更多的血液(見STAR方法)正勒。
我們進(jìn)行了解剖區(qū)域之間的差異基因表達(dá)(DGE)分析(圖2H；表S2)和每個簇上調(diào)基因的基因集富集分析(圖S2A)傻铣。與肌肉收縮和發(fā)育相關(guān)的基因本體(GO)特征在所有心肌簇(0章贞、1、2非洲、3和4)中都被檢測到鸭限，而致密心肌(簇0)的代謝豐富。這三個小梁簇(1两踏、2和3)可以通過它們在傳導(dǎo)(簇1和簇2)和氧化代謝(簇3)方面的富集來區(qū)分(圖S2A)败京。此外，2簇顯示了MB和NPPA的差異表達(dá)(圖2H)梦染，這與氧轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)分泌活性增強(qiáng)有關(guān)(Lin et al., 1990)赡麦。因此，不同的小梁心肌簇可能對應(yīng)于小梁的不同成分弓坞，如與壁相關(guān)的隧甚、乳頭肌或浦肯野纖維车荔。心房心肌(簇4)也顯示NPPA(內(nèi)分泌活性)的差異表達(dá)(圖2H)渡冻，以及與傳導(dǎo)和心率調(diào)節(jié)相關(guān)的基因(圖S2A)。另一方面忧便，OFT族吻、房室和縱隔間充質(zhì)帽借，以及心外膜(第5、6超歌、7和9簇)表現(xiàn)出相似的GO特征砍艾，它們與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)，并具有不同程度的血管和動脈形態(tài)發(fā)生巍举。簇5脆荷、6和7也豐富了與心臟瓣膜和間隔發(fā)育相關(guān)的特征(圖S2A)。簇9顯示了心外膜標(biāo)志物ALDH1A2(Moss et al., 1998)懊悯、LRP2和ITLN1以及心外膜和心外膜衍生細(xì)胞(EPDC)標(biāo)志物TBX18的表達(dá)(Cai et al., 2008; Wu et al., 2013)(圖2H蜓谋；表S2)。對OFT簇(簇5)的更深入研究發(fā)現(xiàn)炭分，主要在發(fā)育后期(6.5和9PCW)的樣本中檢測到了OFT簇桃焕，顯示成纖維細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)豐富(如ELN、SPARC和OGN)和平滑肌相關(guān)基因如ACTA2和MYH11的表達(dá)(圖2H)捧毛。這些標(biāo)記物在早期4.5-5PCW組織的房室間充質(zhì)遠(yuǎn)端的表達(dá)要弱得多(圖S2B)观堂，這意味著當(dāng)OFT從房室間充質(zhì)生長出來時，它的肌化和較大血管的形成開始在更遠(yuǎn)的地方發(fā)展呀忧，在那里可以發(fā)現(xiàn)心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞师痕。
總而言之，這些結(jié)果表明而账，在所研究的時間窗口(4.5-9 PCW)內(nèi)七兜，空間基因表達(dá)在胚胎發(fā)育早期建立并一直保持，心臟內(nèi)部區(qū)域之間的基因表達(dá)差異比時間點(diǎn)之間的差異更明顯福扬。
6.5-7PCW人胚胎心臟的單細(xì)胞基因表達(dá)分析
因為ST點(diǎn)含有基因表達(dá)特征腕铸。平均30個細(xì)胞(圖S1L-S1O)，我們用scRNA-seq分析了6.5個PCW組織樣本的基因表達(dá)異質(zhì)性铛碑。具體地說狠裹，我們檢查了6.5-7PCW樣本的生物復(fù)制(即第二個人類胚胎心臟組織樣本)，因為IHC染色表明中間時間點(diǎn)顯示了在其他兩個階段識別的解剖學(xué)特征汽烦。組織被解剖成兩個區(qū)域不同的部分：一個包含OFT涛菠、房室結(jié)構(gòu)和大部分心房，另一個包含心室撇吞。這促進(jìn)了細(xì)胞的分離俗冻，同時保留了所研究的細(xì)胞是來自心臟上部還是下部的信息。
使用10X Genomics Chromium workstation牍颈，我們生成了3,717個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜迄薄，在質(zhì)量調(diào)整和過濾之后，平均每個細(xì)胞2900個基因煮岁，11,000個唯一轉(zhuǎn)錄本(圖S3A-S3C讥蔽；表S1B)涣易。
為了驗證這個6.5PCW心臟樣本可以被認(rèn)為是ST分析的6.5PCW心臟的生物復(fù)制，我們比較了兩個樣本的scRNA-seq和ST Bulk基因表達(dá)的相似性冶伞。觀察到了很強(qiáng)的相關(guān)性(r=0.93新症；圖3A)，證明了生物學(xué)比較的合理性响禽。我們鑒定了兩個6.5個PCW樣本之間共有的18,046個基因徒爹，其中2,027個基因僅在scRNA-seq樣本中表達(dá)，1,174個基因是ST樣本所獨(dú)有的芋类。
在ST樣本中唯一檢測到的大多數(shù)基因都是Y連鎖基因(例如TTTY14瀑焦、TTTY15和ZFY)，這是不同性別代表的結(jié)果梗肝。在scRNA-seq樣本中XIST基因的過表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(Ray et al., 1997)榛瓮。此外，當(dāng)檢查僅在scRNA-seq樣本中發(fā)現(xiàn)的基因時巫击，我們觀察到與免疫反應(yīng)(例如FCGR2B和IL6)以及細(xì)胞增殖和凋亡(IL1B)相關(guān)的基因禀晓，表明這些過程在單細(xì)胞庫制備之前的解離步驟中被激活。
最后坝锰，我們對兩個單細(xì)胞組分的基因表達(dá)譜進(jìn)行了降維和聚類粹懒，確定了15個細(xì)胞簇(圖3B)，并根據(jù)標(biāo)記基因的表達(dá)將其分類為細(xì)胞類型(表S3)顷级。我們能夠識別已知的心肌細(xì)胞類型凫乖，從心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞到平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。此外弓颈，我們還檢測到三種類型的心肌細(xì)胞帽芽，即心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞、雪旺祖細(xì)胞翔冀、心外膜細(xì)胞导街、EPDCs(Master and Riley，2014纤子；Sylva et al.搬瑰，2014)，兩種類型的內(nèi)皮細(xì)胞控硼，以及四種類型的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞泽论。某些細(xì)胞團(tuán)僅在細(xì)胞組分(I)中檢測到(圖3C)，提示心臟上部細(xì)胞多樣性豐富卡乾，包括OFT翼悴、心房肌、房室心外膜下間充質(zhì)说订、瓣膜裝置和帶有肺靜脈的縱隔組織抄瓦。
心臟發(fā)育過程中細(xì)胞基因表達(dá)圖譜的構(gòu)建
為了闡明人類胚胎心臟中存在的不同細(xì)胞類型的空間分布及其空間域的異質(zhì)性潮瓶，我們利用ISS的亞細(xì)胞空間分辨率陶冷，將其應(yīng)用于ST分析的三個心臟組織钙姊，使得以單細(xì)胞分辨率進(jìn)行基因表達(dá)的時空分析成為可能。為此埂伦，我們設(shè)計了一個基因小組煞额，用來自兩個匹配的6.5-7個PCW生物樣本的ST和scRNA-seq分析的信息。具體地說沾谜，初始基因組的一半由ST鑒定的關(guān)鍵空間標(biāo)記基因組成膊毁，另一半由每個scRNA-seq簇(免疫細(xì)胞除外)的標(biāo)記基因組成，以剖析細(xì)胞類型的異質(zhì)性基跑。我們隨后添加了之前報道的對心臟發(fā)育重要的基因婚温，最終得到了69個基因(表S4A和S4B)。在僅使用面板中包括的69個基因?qū)cRNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行重新聚類后媳否，我們能夠?qū)⒋蠖鄶?shù)細(xì)胞分配到它們的原始簇栅螟；唯一的例外是簇13，其中不包含特定的標(biāo)記基因(圖S4A-S4C)篱竭。我們在所有三個重復(fù)的心臟上進(jìn)行了ISS實(shí)驗(表S4C力图；圖S4D)，并觀察到時間階段內(nèi)的高度相關(guān)性(R2=0.85-0.99)掺逼。我們還使用單分子RNA熒光原位雜交(SmFISH)交叉驗證了三個ISS基因探針的結(jié)果(圖4)吃媒，它產(chǎn)生的模式與測序觀察到的模式相似。
最后吕喘，我們使用ISS的功能和pciSeq方法(Qian et al., 2019)創(chuàng)建了在6.5-7PCW胚胎人類心臟中確定的scRNA-seq定義的細(xì)胞類型的綜合概率空間細(xì)胞圖(圖5)赘那。除了空間位置之外，細(xì)胞映射算法利用scRNA-seq數(shù)據(jù)將讀數(shù)分配給各個細(xì)胞(圖5A氯质、5C和5E)漓概。我們的空間圖包含20，920個單細(xì)胞(即組織切片中細(xì)胞總數(shù)的76.2%)病梢，這些細(xì)胞被成功地分配給scRNA-seq定義的細(xì)胞類型(不包括紅細(xì)胞和免疫細(xì)胞胃珍，它們被排除在分析之外)(圖5B和5D)◎涯埃空間細(xì)胞映射證實(shí)了ST預(yù)測的簇的空間分布觅彰，也解決了由不同細(xì)胞類型形成的更精細(xì)的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)位于彼此接近的位置钮热。
用空間分析方法解開細(xì)胞類型相似性的糾纏
ISS分析顯示填抬，在6.5-7個PCW心臟中，清晰的空間基因表達(dá)模式與所研究的細(xì)胞類型的ST和scRNA-seq結(jié)果一致(不包括免疫細(xì)胞和紅細(xì)胞)隧期。圖6A-6B和S5A中給出了三種技術(shù)之間一致性的示例飒责。ISS的結(jié)果使我們通過將scRNA-seq結(jié)果與相應(yīng)的空間標(biāo)記基因的結(jié)果進(jìn)行比較赘娄，對幾個scRNA-seq簇有了更深入的了解。
值得注意的是宏蛉，我們在第14簇中確定了兩種細(xì)胞類型的亞群：表達(dá)ISL1(Engleka et al., 2012)和STMN2(Anderson and Axel, 1985; Groves et al., 1995; Burzynski et al., 2009)的心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞和表達(dá)ALDH1A1的Schwann祖細(xì)胞(Petersen and Adameyko, 2017; Jessen and Mirsky, 2019)(圖6A)遣臼。這兩種細(xì)胞均存在于縱隔間充質(zhì)和外膜間充質(zhì)中，向心外膜下間充質(zhì)方向也可檢測到雪旺祖細(xì)胞拾并。通過分析三個發(fā)育階段OFT內(nèi)這些基因的ISS圖譜揍堰，我們發(fā)現(xiàn)心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞只出現(xiàn)在發(fā)育的早期，而雪旺祖細(xì)胞只出現(xiàn)在發(fā)育的后期(圖6C和6D)嗅义，而且屏歹，心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞在任何時間點(diǎn)都不存在于心外膜下間充質(zhì)中(圖6E和6F)，但在發(fā)育的后期之碗，雪旺祖細(xì)胞才出現(xiàn)在這個區(qū)域中(圖6C和6D)蝙眶。
我們還確定了心外膜細(xì)胞(第9群)和EPDCs(第3群)之間的主要區(qū)別。心外膜細(xì)胞以ITLN1的表達(dá)為特征褪那，主要分布于心臟周圍的心外膜層幽纷。標(biāo)記基因TBX18在這兩種細(xì)胞類型中都有表達(dá)(Wu et al., 2013)，而TCF21(Braitsch and Yutzey, 2013)更多地定位于心外膜下武通，在那里發(fā)現(xiàn)了EPDCs(圖6B)霹崎。圖6E和圖6F中的時間分析顯示了心外膜細(xì)胞(ITLN1，TBX18)和EPDCs(TBX18)在所有三個時間點(diǎn)的房室外膜下間充質(zhì)內(nèi)的定位冶忱。在4.5-5PCW的心臟中尾菇，心外膜幾乎覆蓋在心包表面，只有發(fā)育中的心外膜下的痕跡可見囚枪。相反派诬，在后兩個時間點(diǎn)，房室心外膜下間充質(zhì)已經(jīng)形成并由EPDCs填充链沼。其他技術(shù)重復(fù)樣本也得到了類似的結(jié)果(圖S5B-S5E)默赂。
我們還解剖了由EPDCs(簇3)和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(簇2、4括勺、5和8)組成的scRNA-seq簇團(tuán)聚體(圖3B)缆八。對這些群集進(jìn)行更深入的檢查發(fā)現(xiàn)，它們具有不同的空間位置和獨(dú)特的功能屬性(圖S5A和S6)疾捍。EPDCs主要存在于房室外膜下間充質(zhì)(圖6G)奈辰，主要參與器官和肌肉的發(fā)育(圖S6B)。在成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞中乱豆，與簇2相關(guān)的細(xì)胞主要位于OFT的底部和瓣膜結(jié)構(gòu)內(nèi)奖恰，而與簇5相關(guān)的細(xì)胞主要位于OFT內(nèi)，參與OFT的形態(tài)發(fā)生。房室心外膜下間充質(zhì)中也有簇5的表達(dá)瑟啃，提示參與了冠狀動脈的形成(圖S6)论泛。群4和群8具有相似的空間格局。但是蛹屿，第4簇在心外膜下更為明顯屁奏，參與結(jié)締組織的發(fā)育和血管生成，而第8簇則更多地定位于OFT蜡峰，與動脈和主動脈的形態(tài)發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)控更具特異性了袁。
重要的是朗恳，我們發(fā)現(xiàn)了三種類型的心肌細(xì)胞(圖3B)湿颅，這三種類型的心肌細(xì)胞在所有三個研究的發(fā)育階段都被檢測到。其中兩個表達(dá)心房和心室肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記粥诫，與其空間定位一致(圖S5A)油航。相反，第三個群體怀浆，表達(dá)MYOZ2和FABP3谊囚，定位于心房和心室，但以前在人類心臟發(fā)育中沒有描述過执赡。我們將這一新的心肌細(xì)胞群體命名為Myoz2富集的心肌細(xì)胞镰踏，因為它最近在成年小鼠心臟中被報道過(Gladka et al., 2018)。
最后沙合，對兩種內(nèi)皮細(xì)胞類型(第0和第10簇)的進(jìn)一步空間觀察顯示奠伪，前一種內(nèi)皮細(xì)胞(稱為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞)主要定位于小梁心肌，那里的血液主要通過較小的血管(主要是毛細(xì)血管)供應(yīng)首懈。相反绊率，后一種類型(注釋為內(nèi)皮/周細(xì)胞/外周細(xì)胞)主要定位于致密心肌，冠狀動脈向心臟供應(yīng)氧合血液(圖S5B-S5E)究履÷朔瘢總而言之，這些發(fā)現(xiàn)證明了空間基因表達(dá)分析在區(qū)分相對相似的細(xì)胞類型的定位和功能方面的關(guān)鍵作用最仑。
為了方便我們圖集的使用藐俺，我們提供了一個公開可用的網(wǎng)絡(luò)資源，用于直觀地探索調(diào)節(jié)人類心臟發(fā)育的空間基因表達(dá)模式(https://hdca-Sweden.scilifelab.se/a-Study-on-Human-Heart-Development/)泥彤。該資源包含ST和scRNA-seq數(shù)據(jù)的瀏覽器欲芹、ISS信息的查看器和6.5 PCW胚胎心臟的3D查看器。建立3D模型的9個ST組織切片可以詢問全局和單個空間基因表達(dá)模式全景，以便研究心臟器官發(fā)生的一般和詳細(xì)動力學(xué)(圖7A)耀石。此外，從ISS數(shù)據(jù)導(dǎo)出的空間細(xì)胞圖與3D模型對齊，以提供細(xì)胞分辨率(圖7B)滞伟。
討論
了解調(diào)節(jié)器官和疾病發(fā)展的不同細(xì)胞類型的生物學(xué)功能揭鳞、網(wǎng)絡(luò)和相互作用需要細(xì)胞信息和空間背景。報告了將空間信息與scRNA-seq數(shù)據(jù)相結(jié)合的各種開創(chuàng)性方法(Moncada et al., 2019; Achim et al., 2015; Satija et al., 2015; Karaiskos et al., 2017)梆奈。然而野崇，其中大多數(shù)是通過利用現(xiàn)有的原位雜交標(biāo)志性基因數(shù)據(jù)來研究模式生物發(fā)展的計算策略(Achim et al., 2015; Satija et al., 2015; Karaiskos et al., 2017)。由于模型系統(tǒng)不能反映物種之間的細(xì)微差異亩钟，這類詳細(xì)信息不容易應(yīng)用于人類器官發(fā)生的研究乓梨。因此，顯然需要人類發(fā)育組織的空間分辨單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)清酥。
在這里扶镀，我們提出了一種創(chuàng)新的方法，它結(jié)合了三種不同技術(shù)(ST焰轻、scRNA-seq和ISS)的力量臭觉，以單細(xì)胞分辨率在器官水平上綜合表征人類心臟形態(tài)發(fā)生過程中基因表達(dá)的空間和時間差異。我們獲得了四個人胚胎心臟的轉(zhuǎn)錄快照辱志，橫跨三個不同的發(fā)育階段(4.5-5蝠筑，6.5-7和9個PCW)，從而能夠分析心臟結(jié)構(gòu)形成的進(jìn)程揩懒。雖然研究早期人類心臟組織的形成過程非常有趣什乙，但這樣做會帶來很大的實(shí)際困難。
這些技術(shù)中的每一項都有關(guān)鍵功能已球，使我們能夠生成發(fā)育中的人類心臟的分辨率良好的細(xì)胞圖譜臣镣。我們使用ST的探索能力來確定三個發(fā)育階段共有的空間全基因組表達(dá)模式。此外和悦，利用scRNA-seq對發(fā)育中期的細(xì)胞類型異質(zhì)性進(jìn)行了降維處理退疫。這兩項技術(shù)的結(jié)合使我們能夠識別出一套全面的基因探針，這些探針可以總結(jié)空間和細(xì)胞信息鸽素，重現(xiàn)人類心臟發(fā)育過程中的整體復(fù)雜性褒繁。最后，ISS的目標(biāo)分辨率使我們能夠創(chuàng)建跨越三個發(fā)育階段的精細(xì)化亞細(xì)胞基因表達(dá)圖譜馍忽。通過這種方式棒坏，我們建立了一種在細(xì)胞水平上研究人類心臟發(fā)育過程中時空基因表達(dá)模式的分子方法。
我們協(xié)同使用這些技術(shù)揭示了全局空間基因表達(dá)模式是在胚胎心臟發(fā)育的早期(4.5-5PCW)建立的遭笋，并一直維持到9PCW坝冕。特別是，我們觀察到心室和心房肌瓦呼、房室間充質(zhì)喂窟、心外膜和OFT區(qū)域的保守空間基因表達(dá)模式。相反，在三個發(fā)育階段磨澡，心外膜碗啄、EPDC的形成與成纖維細(xì)胞、血管結(jié)構(gòu)稳摄、纖維環(huán)稚字、瓣膜和肌肉結(jié)構(gòu)的形成之間的聯(lián)系在時空上存在差異。在這三個發(fā)育階段厦酬，心外膜胆描、EPDC的形成與成纖維細(xì)胞、血管結(jié)構(gòu)仗阅、纖維環(huán)以及瓣膜和肌肉結(jié)構(gòu)的形成之間的聯(lián)系存在時空差異昌讲。具體地說，ST鑒定的心外膜空間標(biāo)記基因在單細(xì)胞分析中被標(biāo)注為心外膜細(xì)胞和EPDCs的兩種細(xì)胞類型表達(dá)霹菊。將這些基因包括在我們的ISS基因小組中表明剧蚣，盡管4.5-5PCW心臟的表面被心外膜細(xì)胞覆蓋支竹，但通過上皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)變形成EPDC才剛剛開始旋廷，在這個發(fā)育階段。在發(fā)育后期礼搁，心外膜下間充質(zhì)中EPDC的形成一直持續(xù)饶碘，可能隨后促進(jìn)了幾種成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的分化。目前尚不清楚EPDCs是否也能分化為心肌細(xì)胞馒吴，或通過外體影響心肌細(xì)胞的分化扎运。
另一個值得注意的發(fā)現(xiàn)是，心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞和雪旺祖細(xì)胞表現(xiàn)出截然不同的時空模式饮戳。具體地說豪治，心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞在心臟發(fā)育的早期階段獨(dú)特地存在于縱隔和OFT中。這證實(shí)了Keyte等人(2014)的分析扯罐，他認(rèn)為在這里分析的發(fā)育階段负拟，心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞是OFT進(jìn)入主動脈和肺成分的間隔所必需的。相反歹河，雪旺祖細(xì)胞在發(fā)育后期首先出現(xiàn)在縱隔和OFT掩浙。此外，在房室心外膜下間充質(zhì)區(qū)域也只有在發(fā)育后期才能看到它們的存在秸歧。心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞和雪旺祖細(xì)胞之間的確切關(guān)系尚未最終解決厨姚。
我們的方法還使我們能夠識別由EPDCs和四種不同的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞類型以及兩種內(nèi)皮細(xì)胞類型組成的scRNA-seq簇狀復(fù)合體內(nèi)的差異。在早期的研究中也觀察到了集群成團(tuán)(DeLaughter et al., 2016; Gladka et al., 2018; Cui et al., 2019)键菱，但之前沒有被解剖過谬墙。我們發(fā)現(xiàn)，四種成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞類型和兩種內(nèi)皮細(xì)胞類型中的每一種都有特定的空間位置，并在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮不同的功能拭抬。此外险耀，我們還發(fā)現(xiàn)，一種獨(dú)特的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞類型(成纖維樣細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞玖喘，scRNA-seq簇5)與內(nèi)皮細(xì)胞一起甩牺，促進(jìn)了發(fā)育中心臟冠狀動脈的形成。
最后累奈，我們鑒定了三種類型的心肌細(xì)胞贬派。其中心房和心室心肌細(xì)胞分別特異定位于心房和心室，而第三種心肌細(xì)胞Myoz2富集存在于兩個解剖區(qū)域澎媒。重要的是搞乏，這個群體有一個類似于最近在成年小鼠心臟中描述的表達(dá)譜(Gladka et al., 2018)，但以前在人類心臟發(fā)育中沒有描述過戒努。鑒于MYOZ2在肥厚性心肌病的一個亞組中的已知作用请敦，探索這一亞組心肌細(xì)胞的生物學(xué)功能可以為研究心臟功能和心臟病理機(jī)制提供重要信息(Osio et al., 2007)。
總而言之储玫，我們使用單細(xì)胞時空方法研究了人類心臟發(fā)育侍筛，并構(gòu)建了一種分子方法，可以用來探索其他信息很少的生物的發(fā)育過程撒穷。我們的方法使得探索組織中的全球空間轉(zhuǎn)錄模式成為可能匣椰，降維描述它們的細(xì)胞異質(zhì)性，并有選擇地針對具有空間異質(zhì)性表達(dá)模式的關(guān)鍵基因端礼，這些表達(dá)模式是導(dǎo)致細(xì)胞類型差異的原因禽笑。據(jù)我們所知，我們的心臟發(fā)育模型是首批具有單細(xì)胞空間分辨率的器官范圍的人類發(fā)育-轉(zhuǎn)錄圖譜之一蛤奥。為了方便它的開發(fā)佳镜，我們創(chuàng)建了一個公開可用的網(wǎng)絡(luò)資源，可以用來研究和可視化2D和3D模型(https://hdca-sweden.scilifelab.se/a-study-on-human-heart-development/)凡桥，以了解心臟發(fā)育過程中的時空基因表達(dá)模式蟀伸。這些模型清楚地表明，空間和時間信息與單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)的整合對于識別細(xì)胞類型之間的關(guān)鍵差異和詳細(xì)分析發(fā)育中的組織是必不可少的唬血。
