美國密西西比大學Christian R. Gomez博士于2018年發(fā)表在Clinical Lymphoma, Myeloma & Leukemia的文章Genetic Mutations in B-Acute Lymphoblastic Leukemia Among African American and European American Children
摘要
與歐美兒童相比漾肮，患有急性B-淋巴細胞白血病的非裔美國兒童的存活率較低慎陵。為了發(fā)現種族特異性遺傳異常導致人群特異性風險，我們進行了一項全外顯子組測序研究。雖然大多數基因畸變在兩個群體之間是共同的荷憋，但很少是針對每個種族的罐脊。我們的研究揭示了遺傳變異，為解釋種族特異性白血病的發(fā)生提供了線索枯怖。
背景：與歐美兒童（EA）相比注整，非裔美國人（AA）兒童急性B-淋巴細胞白血病（B-ALL）患者的生存率明顯較低。在這里肿轨，我們提出了一項完整的外顯子組測序（WES）研究寿冕，顯示種族特異性基因變異可能在患有B-ALL的AA和EA兒童的不同結果中發(fā)揮作用。
患者和方法：入選5例AA和15例EA患者萝招，年齡從1歲到18歲蚂斤。原始細胞比例百分比中位數為94.8%（范圍64.5%-99.9%）。冷凍骨髓抽提物用于提取DNA槐沼，并進行WES曙蒸，重點關注種族和B-ALL特異性種系突變。
結果：大多數遺傳變異（n=339）在AA和EA兒童之間共享岗钩。一些基因畸變僅在AA（n=58）和EA（n=52）中發(fā)現纽窟，在AA中，基因畸變聚集在與端粒酶信號和癌癥信號相關的典型途徑中兼吓。在EA中臂港，獨特的遺傳畸變聚集在與干細胞多能性和遺傳性癌癥相關的途徑中。
結論：我們的研究揭示了信號網絡中的異常遺傳畸變视搏，這可能有助于特定種族的白血病發(fā)生审孽。我們的結果表明，WES作為一種工具浑娜，對患有B-ALL的AA和EA兒童的個體基因特征和基因評分的發(fā)展具有價值佑力。這些發(fā)現可能最終影響疾病管理，并有助于消除患有B-ALL的AA兒童出現的不同結果筋遭。
介紹
急性淋巴細胞白血泊虿（B-ALL）是美國診斷的最常見的兒童惡性腫瘤。白血病幾乎占所有兒童癌癥的三分之一（29%）漓滔。在兒童和青少年中编饺，大約四分之三的白血病是急性淋巴細胞白血病（ALL）响驴。它是兒童癌癥相關死亡的主要原因透且。在過去的幾十年中，被診斷為B-ALL的兒童的死亡率和發(fā)病率有了顯著的提高踏施，現在總的5年生存率超過85%石蔗。這在一定程度上是由于多藥化療的療效和根據患者特征、白血病生物學特征和早期治療反應（如第8天或第15天骨髓）對治療強度進行風險分層的進展畅形。這些進展預示著將白血病基因組學整合到當代治療中的精確醫(yī)學策略的前景和挑戰(zhàn)养距。
盡管取得了這一進展，但基于種族和種族差異的B-ALL患兒治療方面仍存在未滿足的需求日熬。早期的研究表明棍厌，不同種族和族裔群體的存活率不同。在Bhatia等人的多變量分析中，非裔美國人（AA）耘纱、西班牙裔敬肚、亞裔和歐美裔（EA）兒童的生存率不同，其中AA和西班牙裔兒童的預后更差束析。AA兒童的發(fā)病率和存活率明顯低于EA兒童艳馒。這些結果表明，不明分子因素可能在AA兒童較低的存活率中起作用员寇，并強調需要進行前瞻性調查分析弄慰。雖然遺傳的個體間遺傳變異（通常與種族或族裔群體的地理祖先有關）可能導致種族和族裔差異，但“候選”途徑中的遺傳變異對所有種族差異的影響結果不一致蝶锋。我們目前對白血病發(fā)生始發(fā)事件的理解仍然不足以解釋健康差異和治療耐藥性的生物學和分子基礎陆爽。高通量微陣列、基因分型和下一代測序（NGS）技術為白血病發(fā)生扳缕、耐藥性和宿主藥物基因組學提供了新的見解慌闭，從而確定了新的白血病亞型并提出了潛在的治療靶點。
大多數B-ALL患者反復出現結構性染色體重排躯舔，這是白血病發(fā)生的重要始發(fā)事件驴剔，但不足以解釋健康差異和抗藥性的分子基礎。B-ALL基因組圖譜的最新進展粥庄，包括全基因組關聯研究（GWAS）仔拟，使人們進一步了解了該疾病的遺傳背景，并發(fā)現了可能影響種族差異的不同遺傳因素飒赃。GWAS已經確定了5個可能在B-ALL發(fā)病機制中起作用的基因組位點。候選基因關聯研究的薈萃分析確定了可能影響B(tài)-ALL風險的16個基因多態(tài)性變異的47項研究科侈，并在25個多態(tài)性變異中僅觀察到8個具有統(tǒng)計顯著性（P<0.05）關聯载佳，估計假陽性概率大于0.2。
一項研究表明臀栈，ARID5B單核苷酸多態(tài)性49個中有10個與EA和西班牙裔之間B-ALL易感性的種族差異有關蔫慧，并在隨后的研究中得到驗證。因此权薯，遺傳多態(tài)性可能是B-ALL人群特異性風險的生物學基礎姑躲。這些研究已經確定了兒童癌癥的潛在治療靶點和驅動突變。然而盟蚣，為了剖析健康差異的分子基礎黍析，目前還沒有最佳研究設計或分析策略的黃金標準。此外屎开，目前的治療成功率是建立在使用細胞毒性化療和放射療法的基礎上的阐枣，這些化療和放射療法通常會產生顯著的不良反應，最終會降低幸存者的生活質量。
材料和方法
病人
在研究開始之前蔼两，密西西比大學醫(yī)學中心（UMMC）獲得了機構審查委員會（IRB 2013—0250）的批準甩鳄。書面知情同意書由每個孩子的父母或監(jiān)護人提供。來自UMMC的20名新診斷疾病的B-ALL獨立兒科患者被納入本研究额划。表1總結了患者的人口統(tǒng)計學妙啃，包括疾病特征和其他血液學指標，通過骨髓差異計數進行評估俊戳。兒童年齡介于1至18歲之間揖赴，平均年齡為4歲。其中11人（55%）為女性品抽，9人（45%）為男性储笑。5例（25%）為AA，15例（75%）為EA圆恤⊥槐叮回顧了臨床病史、血象盆昙、流式細胞術羽历、免疫表型、形態(tài)學淡喜、細胞遺傳學和先前的分子數據秕磷。
在我們的研究中，只有1名患者在治療后復發(fā)炼团，并于2017年底死亡澎嚣。骨髓樣本中的細胞百分比中位數為100%（范圍70%-100%），AA為100%（范圍100%-100%）瘟芝，EA為100%（范圍70%-100%）易桃。原始細胞的中位數百分比為94.8%（范圍64.5%-99.0%），AA為94.5%（范圍86.0%-98.5%）锌俱，EA為95.0%（范圍64.5%-99.0%）晤郑。大多數患者接受了3或4種治療藥物的方案，包括長春新堿贸宏、聚乙二醇化糖皮質寡糖天冬酰胺酶和地塞米松/強的松或長春新堿造寝、聚乙二醇化糖皮質寡糖天冬酰胺酶、柔紅霉素和地塞米松/強的松吭练。此外诫龙，患者給予鞘內阿糖胞苷和甲氨蝶呤。藥物管理通常在樣本采集后1至2天開始鲫咽。
DNA提取與WES
在2013年至2016年期間赐稽，根據研究方案在診斷時收集了骨髓抽吸物（5 mL）叫榕，并獲得了所有參與者的知情同意。新鮮骨髓樣本通常經過處理姊舵，用于分子分析晰绎，包括。然而括丁，本研究的樣本在采集時常規(guī)冷凍和儲存荞下。由于冷凍骨髓樣本可用于DNA提取，且與WES兼容史飞，因此我們決定對樣本的提取技術進行標準化尖昏。骨髓樣本解凍并過濾以清除骨或脂肪殘留物。按照制造商的方案（Qiagen构资，QIAmp DNA血液試劑盒）抽诉，使用200ml冷凍骨髓抽提物提取DNA。加入RNAseA以消除RNA的空間吐绵。典型產率約為5.0±7.2mg迹淌，OD260/280純度比接近1.8被認為是可接受的。進一步的質量控制在UMMC的分子和基因組中心進行己单。在量子化熒光光度計上進行高靈敏度定量唉窃，并在RNA生物分析儀（Agilent Technologies）上運行樣品∥屏可接受的DNA量(總計>200 ng)纹份，生物分析儀中沒有RNA峰表明處理測試樣品成功。
文庫制備在位于路易斯安那州新奧爾良路易斯安那州立大學健康科學中心斯坦利S.斯科特癌癥中心的翻譯基因組核心完成廷痘，使用50 ng DNA的TRUSEQ外顯子組樣本制備試劑盒（Illumina）蔓涧。對核酸進行機械破碎（Covaris Inc.）以產生150 bp的片段。對片段進行純化笋额，并通過擴增步驟蠢笋，獲得包含指數的適配器序列，以便在分析步驟中分離樣品鳞陨。通過聚合酶鏈反應擴增文庫，使用安捷倫生物分析儀2100測定文庫質量瞻惋，并通過熒光測定法（Qubit）定量厦滤。使用Illumina（TruSeqExome）提供的試劑和說明，以2×75 bp（配對末端方案）的長度對文庫進行測序歼狼，該文庫提供至少75×覆蓋率（8個樣本pool）掏导。簡單地說，將匯集的文庫（每個文庫8個）調整到1.8pM羽峰，并通過含有寡核苷酸的流細胞沖洗趟咆，寡核苷酸是適配器的組成部分添瓷。然后將該池“固定”到離流細胞上并原位擴增。每個DNA分子作為簇生成的模板值纱。聚類后鳞贷，樣本在NextSeq500 Illumina測序儀中進行測序。使用SCS v2.10/RTA v1.9軟件（Illumina）執(zhí)行Base calling虐唠。
生物信息學分析
通過NGS管道分析WES搀愧，包括mapping、質控和變體calling3個步驟疆偿。首先咱筛，來自Illumina NextSeq的所有樣本通過(fastqc:http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)質量控制，使用Burrows-Wheeler比對（BWA杆故，http://bio-bwa.sourceforge.net/)迅箩，為每個樣本生成4個雙端BAM文件。其次处铛，為了提高校準質量饲趋，我們使用寬GATK Realigner（GATK:https://software.broadinstitute.org/gatk/)為了減少INDEL的錯誤次數，然后進行基本質量分數重新校準罢缸，以減少測序機產生的偽影篙贸，并用Picard對每個BAM文件標記聚合酶鏈反應的重復。我們通過合并4個配對端重新校準和校準的BAM獲得樣本級BAM枫疆。在第三步中爵川，Varscan(http://varscan.sourceforge.net/)調用每個樣本的變體調用（單核苷酸多態(tài)性--SNPs和INDELs）并由ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)用于基于基因的變異功能注釋。與基因功能障礙相關的任何單核苷酸變異和插入/缺失（INDEL）（即非同步單核苷酸變異息楔、移碼插入/缺失）被總結為基因水平畸變寝贡。
結果
對2013年至2016年間在UMMC兒童醫(yī)院接受B-ALL治療的20名兒童患者（5例AA和15例EA）診斷時獲得的冷凍骨髓DNA進行WES（~100倍）。為了比較AA和EA之間的群體差異值依，我們將重點放在種系突變上圃泡，因為它們可以反映群體遺傳信息，并且可以從上一代遺傳愿险。為了進一步區(qū)分突變類型颇蜡，我們將我們的結果與565個最可靠的兒童癌癥易感基因進行種系突變分析。Zhang等人22通過仔細審查美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院的基因列表和PubMed文獻檢索辆亏，總結了這些基因风秤。從我們的結果中，我們發(fā)現449個具有種系突變的基因與565個基因列表重疊扮叨。大多數（n=339）在AA和EA之間共享（圖1）缤弦，包括存在于間變性淋巴瘤受體酪氨酸激酶（ALK）基因中的那些（圖2）。我們發(fā)現一些遺傳異常對AA（n=58）是特異性的彻磁，如5例患者的脂肪瘤首選伙伴基因（LPP）（圖2）碍沐，4例患者的TNF-α誘導蛋白3（TNFAIP3）和黑色素前體蛋白（PMEL）狸捅。
例如，在8名患者中發(fā)現白血病抑制因子受體（LIFR）累提，其中7名患者的LIFR基因第17外顯子p.V785I處發(fā)生錯義突變尘喝，如圖2所示。表3總結了具有非同義種族特異性種系畸變的最常見基因刻恭。
圖1 AA和EA獨有的胚系突變情況
圖2 來自不同群體的大多數突變基因的種系位點突變示例
表3 排除非裔美國人與歐洲裔美國人共有突變瞧省，具有非同性畸變的前10種種系基因
我們進行了一項通路分析，試圖建立與觀察到的畸變相關的參數（ingenuity通路）鳍贾。該分析表明鞍匾，與種族無關，顯示與疾病和生物功能相關的畸變的通路與癌癥骑科、遺傳性疾病橡淑、器官損傷和異常有關，血液病咆爽。有趣的是梁棠，AA（表4）和EA（表5）之間的標準路徑不同。對于AA而言斗埂，與端粒酶信號傳導符糊、干細胞多能性、癌癥信號傳導呛凶、急性髓系白血病和慢性髓系白血病相關的途徑表明生殖系畸變的發(fā)生率較高男娄。在EA中，與干細胞多能性漾稀、遺傳性癌癥模闲、同源重組和癌癥轉移相關的基因中的畸變更為普遍。
表4
表5
討論
高通量NGS技術的使用一定程度促進了人們對B-ALL患者差異遺傳基礎的理解崭捍。然而尸折，目前還沒有一個最佳的研究設計或分析策略的標準來劃分健康差異的分子基礎。通過高通量基因分型殷蛇，對患有B-ALL的兒科患者進行的多個GWAS研究已經完成实夹，并且在EA中發(fā)現了許多遺傳易感性位點。然而粒梦，缺乏關于AA的研究亮航，最近的數據表明，并不是所有B-ALL的風險等位基因都將通過僅限于EA的研究揭示出來谍倦。我們對整個外顯子組進行測序，以剖析患有B-ALL的AA和EA兒童患者中健康差異的分子基礎泪勒。通過努力昼蛀，在患有B-ALL的AA和EA兒童中發(fā)現了特異的白血病發(fā)生分子宴猾。種族特異性變異可能導致白血病的人群特異性風險，并闡明AA和EA人群之間潛在健康差異的分子機制叼旋。此外仇哆，我們的研究結果表明，WES作為一種工具對于患有B-ALL的AA和EA兒童個體基因特征和基因評分的開發(fā)具有價值夫植。
遺傳變異的普遍性可能導致患有B-ALL的AA和EA兒童在發(fā)病率和結局方面的差異讹剔。本研究揭示的異常生物網絡為區(qū)分具有種族特異性非同義變異的種系基因提供了信息。這些發(fā)現在將來可以為針對相關問題的研究提供線索详民，例如與建立體細胞突變相關的研究延欠。可能參與種族特異性白血病發(fā)生的基因畸變和信號網絡沈跨。示例（圖2）包括PPP-AAs和LIFRIN-EAs由捎。在所有AA患者中都發(fā)現了LPP的變體。LPP作為細胞核中的一種特異性共激活劑饿凛，并在細胞遷移中發(fā)揮作用狞玛。已發(fā)現LPP在脂肪瘤中上調，因為它在平滑肌細胞中起作用涧窒，盡管之前尚未顯示心肪，我們的研究表明LPP可能在種族特異性白血病發(fā)生中發(fā)揮作用。當然纠吴，后者可能是由于缺少足夠的公開信息硬鞍。在15例EA患者中，有8例發(fā)現了LIFR的變異呜象。
LIFR的過度表達與各種實體瘤有關膳凝，包括乳腺癌、皮膚癌恭陡、結直腸癌和鼻咽癌蹬音。有報道稱，這些基因在B-ALL患兒中的表達休玩。然而著淆，它們在預測癌癥特異性疾病中的適用性尚不清楚。我們研究的限制因素是僅限于一個治療地點的小樣本量以及與正常人群比較的可行性拴疤。這些局限性妨礙了與正常人群相關的特定等位基因種族特異性風險的研究永部。此外，我們沒有將基因變異與差異基因表達和臨床數據（包括復發(fā)率）聯系起來呐矾。
結論
總之苔埋，我們的研究結果表明，在患有B-ALL的兒童患者中蜒犯，種族相關WES基因特征的聚集可能有助于改善其骨髓抽吸物的預后分類组橄。將來荞膘，本研究衍生的生物標志物小組可能有助于指導風險分層、藥物開發(fā)和治療決策玉工，以幫助減少患有B-ALL的AA和EA兒童的醫(yī)療差異羽资。
