今天分享一個(gè)同樣來(lái)自小鼠單細(xì)胞圖譜課題組的另外一篇文章悍缠，在《Nature》上發(fā)表的，題目是“A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse”。文中報(bào)道了隨衰老變化的詳細(xì)的分子和細(xì)胞類型特異性的細(xì)胞圖譜姓惑。
在這個(gè)研究中評(píng)估了不同年齡特征的細(xì)胞類型特異性表現(xiàn)，如衰老锯仪、基因組不穩(wěn)定性和免疫系統(tǒng)變化，同時(shí)趾盐，對(duì)于不同器官的細(xì)胞類型的變化進(jìn)行評(píng)價(jià)比較卵酪，最終構(gòu)建了包含豐富的分子生物學(xué)信息的轉(zhuǎn)錄圖譜，即小鼠衰老細(xì)胞圖譜谤碳，它提供了關(guān)于衰老最重要的特征是如何體現(xiàn)在廣泛的組織和細(xì)胞類型中的分子信息，進(jìn)一步加深了對(duì)于衰老的相關(guān)過(guò)程變化的理解溢豆。
在實(shí)驗(yàn)中首先對(duì)來(lái)自6個(gè)年齡組（1個(gè)月到30個(gè)月）的雄性和雌性C57BL/6JN小鼠進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序(圖1a)蜒简。實(shí)驗(yàn)中制備了小鼠膀胱、骨髓等23個(gè)器官的單細(xì)胞懸液漩仙。采用微流體滴法收集所有6個(gè)年齡組的數(shù)據(jù)搓茬，在微孔板中選擇3個(gè)月、18個(gè)月和24個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)的單細(xì)胞進(jìn)行分選队他。液滴數(shù)據(jù)使用3′端計(jì)數(shù)對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行分析卷仑，而FACS數(shù)據(jù)允許對(duì)更少量的細(xì)胞進(jìn)行更高靈敏度的測(cè)量，并允許獲取整個(gè)轉(zhuǎn)錄子長(zhǎng)度的序列信息（Extended Data Fig. 1）麸折。對(duì)同一只老鼠的多個(gè)器官的分析使我們能夠獲得受年齡锡凝、環(huán)境和表觀遺傳影響控制的數(shù)據(jù)。
基于前面發(fā)表的小鼠全組織單細(xì)胞圖譜注釋信息垢啼，來(lái)對(duì)新數(shù)據(jù)進(jìn)行半自動(dòng)化注釋(圖1b)窜锯。從中獲得了之前未在群體中發(fā)現(xiàn)的許多細(xì)胞類型，并提供了大量的特征基因表達(dá)譜相關(guān)的新信息芭析。然后采用bbknn批處理對(duì)齊算法來(lái)校正方法相關(guān)的批處理效果锚扎，批處理校正后，使用無(wú)偏見的馁启、基于圖象的聚類方法對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行聚類分析(圖1c-d)驾孔，并評(píng)估在同一簇中注釋相似的細(xì)胞的相關(guān)性。例如惯疙，標(biāo)注為B細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞翠勉，無(wú)論其來(lái)源組織或處理方法如何，都傾向于占據(jù)相同的簇(圖1e-f)霉颠。
單細(xì)胞數(shù)據(jù)能夠解決大量實(shí)驗(yàn)中觀察到的由于群體中每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)變化引起的變化眉菱，或每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)保持不變而該類型的細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化，或者兩者都有掉分。通過(guò)小鼠全組織單細(xì)胞圖譜和RNA-seq數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)變化俭缓，在許多情況下基因表達(dá)的變化是由于兩種細(xì)胞的數(shù)量變化和每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)水平的變化引起的克伊。
Cdkn2a及其蛋白產(chǎn)物p16的表達(dá)是衰老的重要標(biāo)志，因此這個(gè)paper中以此為例研究了表達(dá)Cdkn2a的細(xì)胞是如何隨年齡變化的华坦。FACS和液滴法分析顯示愿吹，高齡小鼠中表達(dá)Cdkn2a的細(xì)胞比例比年輕小鼠高出一倍以上(圖2a-b)，p16在其表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)水平增加了兩倍(圖2c-d)惜姐。Cdkn2a在衰老和表達(dá)它的細(xì)胞中呈現(xiàn)出較高的相關(guān)性犁跪。 每種組織類型的細(xì)胞組成往往隨年齡而變化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)歹袁，隨著年齡的增長(zhǎng)坷衍，膀胱細(xì)胞類型的組成出現(xiàn)了明顯的變化(圖2e)，其膀胱組織間充質(zhì)間室減少了三倍条舔，尿路上皮間室增加了相似的數(shù)量枫耳。觀察發(fā)現(xiàn)膀胱尿路上皮細(xì)胞比例隨年齡增加與已知年齡相關(guān)尿路上皮改變一致。通過(guò)差異基因表達(dá)分析對(duì)組織隨年齡的整體變化進(jìn)行評(píng)估孟抗，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)相關(guān)基因下調(diào)迁杨，而上皮相關(guān)基因上調(diào)，這與觀察的結(jié)果相一致凄硼。同時(shí)铅协，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量下降表明，小鼠膀胱老化可能與較低的器官血管化有關(guān)摊沉，這與最近的發(fā)現(xiàn)以及觀察到的血管相關(guān)基因Htra1和Fos的下調(diào)相一致(圖2f)狐史。 年齡相關(guān)的腎臟也隨著發(fā)生變化。系膜細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞都是腎小球的核心細(xì)胞说墨，它們的相對(duì)含量隨著年齡的增長(zhǎng)而減少(圖2g)预皇，同時(shí)Egf和Atp1a1的表達(dá)在組織范圍內(nèi)減少表明腎小球?yàn)V過(guò)率受損。值得注意的是婉刀，在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞中吟温，局部Atp1a1的表達(dá)均隨年齡增長(zhǎng)而增加，差異基因表達(dá)分析的結(jié)果證明了這一結(jié)論突颊。組織中Umod的表達(dá)減少表明正常的腎臟功能受損(圖2g-h)鲁豪。 在脾臟，T細(xì)胞的比例隨著年齡的增長(zhǎng)而減少律秃，而漿細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量增加爬橡，同時(shí)B細(xì)胞和漿細(xì)胞標(biāo)記基因上調(diào)和Cd3d的下調(diào)(圖2i)。同樣棒动，在乳腺中發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞數(shù)量下降糙申。年齡相關(guān)的T細(xì)胞數(shù)量減少與感染性疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明船惨，這種減少也可能發(fā)生在脾臟和乳腺柜裸。此外缕陕，編碼AP1轉(zhuǎn)錄因子的基因(Junb、Jund和Fos)隨著年齡的增長(zhǎng)而上調(diào)疙挺，這與觀察到的乳腺正常衰老伴隨著該基因家族表達(dá)的增加相一致扛邑。
肝臟的組織結(jié)構(gòu)也隨著年齡的增長(zhǎng)而變化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與年齡相關(guān)的肝細(xì)胞相對(duì)數(shù)量減少铐然，且蛋白的表達(dá)也呈下降的趨勢(shì)蔬崩。之前的研究表明，巨噬細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞衰老搀暑，且肝臟中Il1b基因隨著年齡的變化而呈現(xiàn)顯著的改變沥阳。通過(guò)肝臟普弗細(xì)胞的原位雜交對(duì)Clec4f標(biāo)記和組織成分分析的發(fā)現(xiàn)，Clec4f陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量不隨著年齡的增長(zhǎng)而變化（Extended Data Fig. 6）自点。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)在免疫防御中發(fā)揮獨(dú)特作用桐罕，是肝臟中甘露糖受體(MRC1)的主要載體。研究發(fā)現(xiàn)普弗細(xì)胞Mrc1的表達(dá)隨年齡增加樟氢，而肝臟內(nèi)皮細(xì)胞中Mrc1的總體表達(dá)隨年齡減少。在衰老肝臟中LSECs的吞噬能力下降侠鳄，表明在損傷后LSECs增殖埠啃，或骨髓來(lái)源的LSEC祖細(xì)胞被募集至肝臟。這表明隨年齡變化的LSECs基因特征的改變與其在免疫反應(yīng)中的功能密切相關(guān)伟恶。?
基因組不穩(wěn)定性是衰老最廣泛的特征之一碴开，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)可以分析細(xì)胞突變隨年齡的積累。這個(gè)paper中博秫，作者鑒定了所有FACS樣本的SNP潦牛。基于在75%的細(xì)胞中都表達(dá)的基因挡育，作者發(fā)現(xiàn)所有器官中與年齡相關(guān)的突變數(shù)量增加巴碗，其中舌和膀胱影響最大。通過(guò)ERCC驗(yàn)證了突變的數(shù)量超過(guò)了擴(kuò)增和測(cè)序錯(cuò)誤的預(yù)期(圖3)即寒。盡管由于各種原因橡淆，轉(zhuǎn)錄組會(huì)夸大表觀突變率，很難從轉(zhuǎn)錄組中推斷出全基因組的絕對(duì)突變率母赵，但觀察到的趨勢(shì)對(duì)于估計(jì)突變頻率和基因組的穩(wěn)定性具有非常重要的價(jià)值逸爵。
衰老也會(huì)影響免疫系統(tǒng)。paper中作者對(duì)FACS數(shù)據(jù)中出現(xiàn)的B細(xì)胞和T細(xì)胞受體的序列進(jìn)行了計(jì)算重建分析凹嘲。分別組裝了6050個(gè)B細(xì)胞的受體和6000個(gè)T細(xì)胞的受體(圖4a-b)师倔。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)B細(xì)胞和T細(xì)胞的變化的發(fā)現(xiàn)，24個(gè)月大的小鼠的免疫系統(tǒng)幾乎不能對(duì)新的病原體做出反應(yīng)周蹭。這也與文獻(xiàn)報(bào)道的老年人較年輕人易感性更高趋艘，接種疫苗的益處更低的觀點(diǎn)是一致的疲恢。
最后，研究小組計(jì)算了一個(gè)整體多樣性評(píng)分致稀，以確定哪種細(xì)胞類型更容易受年齡變化的影響冈闭。發(fā)現(xiàn)起源于大腦和腎臟的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的多樣性發(fā)生顯著變化(圖4c)。在大腦骨髓小膠質(zhì)細(xì)胞抖单，大多數(shù)年輕(3月)小膠質(zhì)細(xì)胞聚集成簇1和6萎攒，而衰老的(18個(gè)月和24個(gè)月)小膠質(zhì)細(xì)胞聚集成簇10，12和14(圖4d)矛绘。與簇1和6相比耍休，簇10，12和14富含干擾素反應(yīng)或監(jiān)管的基因货矮，這表明在衰老的大腦中羊精，小膠質(zhì)細(xì)胞的這個(gè)小的促炎亞群有擴(kuò)張的趨勢(shì)。此外囚玫，“年輕”和“年老”簇間差異表達(dá)基因的列表與之前報(bào)道的阿爾茨海默病特異性小膠質(zhì)細(xì)胞特征相似(圖4e)喧锦。關(guān)于腎巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)簇狀細(xì)胞的組成隨年齡發(fā)生顯著變化抓督。簇10主要由1月和3月大小鼠的細(xì)胞組成燃少，而簇13主要由18月、21月铃在、24月和30月大的小鼠的細(xì)胞組成(圖4f)阵具。基因的差異表達(dá)顯示簇10富含M2巨噬細(xì)胞的基因標(biāo)記定铜，而簇13類似于M1促炎巨噬細(xì)胞的狀態(tài)阳液。
