不結(jié)球白菜（Pak-choi）爽蝴，俗稱小白菜沐批，是一種原產(chǎn)于中國(guó)的多葉狀蔬菜，已逐漸在世界范圍內(nèi)種植蝎亚。小白菜易于早熟的特性九孩，限制了生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量積累。因此颖对，了解小白菜的開花調(diào)控機(jī)制對(duì)育種和產(chǎn)業(yè)具有重要意義捻撑。
2024年1月25日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究成果發(fā)表在Plant Physiology期刊上（影響因子7.4）缤底，題目為“ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi byindirectly impairingBcLEAFYexpression”顾患。該研究使用DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）技術(shù)鑒定了小白菜中BcERF070的下游靶基因，揭示了BcERF070響應(yīng)乙烯抑制小白菜開花的潛在分子機(jī)制个唧。
1.BcERF070響應(yīng)乙烯江解，延緩小白菜開花
在外源乙烯處理?xiàng)l件下，小白菜開花延遲徙歼，蓮座葉數(shù)量增加犁河，BcERF070的表達(dá)增加，并在處理2 h時(shí)達(dá)到峰值魄梯。此外桨螺，BcERF070的轉(zhuǎn)錄水平在整個(gè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期逐漸下降，并在生殖期達(dá)到最低酿秸。因此BcERF070參與了乙烯介導(dǎo)的開花調(diào)控灭翔。BcERF070基因沉默后，促進(jìn)小白菜提早開花辣苏，蓮座葉數(shù)量降低肝箱，BcFT誘導(dǎo)表達(dá)哄褒。因此，BcERF070在小白菜開花過程中起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用煌张。乙烯處理的沉默植株開花時(shí)間明顯提前呐赡，但晚于未處理組。由此表明BcERF070并不是參與小白菜開花調(diào)控的唯一途徑骏融。
2.BcERF070與BcMLP328相互作用
采用Y2H實(shí)驗(yàn)篩選到了BcERF070的互作蛋白BcMLP328绎谦，隨后使用BiFC管闷、LCI、GST pull down窃肠、Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果包个。然而，BcERF070和BcMLP328相互作用調(diào)控開花的機(jī)制尚不清楚冤留。
3.BcMLP328促進(jìn)小白菜開花
乙烯處理小白菜促使BcMLP328的表達(dá)量降低。此外纤怒，BcMLP328僅在花器官中高表達(dá)糯而。這表明BcMLP328可能與開花過程有關(guān)。隨后在小白菜中構(gòu)建了BcMLP328的過表達(dá)株系和沉默株系泊窘，通過表型觀察分析和開花相關(guān)基因（BcSOC1熄驼、BcSPL15、BcFT烘豹、BcAP3瓜贾、BcTEM）表達(dá)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BcMLP328促進(jìn)小白菜開花携悯。然而祭芦，BcMLP328促進(jìn)開花的機(jī)制尚不清楚。
4.BcMLP328增強(qiáng)了BcbHLH30對(duì)BcLFY的轉(zhuǎn)錄活性
采用Y2H實(shí)驗(yàn)篩選到了BcMLP328的互作蛋白BcbHLH30，隨后使用LCI轴或、BiFC昌跌、Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了BcMLP328和BcbHLH30在體內(nèi)和體外的互作。隨后在小白菜中構(gòu)建BcbHLH30沉默株系照雁，發(fā)現(xiàn)在沉默株系中開花延遲避矢、蓮座葉增多、開花調(diào)控基因（BcFT和BcLFY）表達(dá)量降低。這些結(jié)果表明审胸，BcbHLH30正調(diào)控小白菜開花過程。
采用Y1H實(shí)驗(yàn)篩選BcbHLH30下游靶基因，發(fā)現(xiàn)BcbHLH30直接結(jié)合花相關(guān)基因BcLFY的啟動(dòng)子曙求，激活其表達(dá)碍庵。LUC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論。隨后悟狱，ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到在過表達(dá)BcbHLH30的小白菜株系中含有CATTTG-box的P2片段被顯著富集静浴，EMSA實(shí)驗(yàn)證明了BcbHLH30與BcLFY啟動(dòng)子區(qū)的CATTTG-box結(jié)合。共轉(zhuǎn)化煙草葉片實(shí)驗(yàn)表明BcMLP328增強(qiáng)了BcbHLH30對(duì)BcLFY的激活能力挤渐。
5.BcERF070削弱了BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對(duì)BcLFY的激活
為了驗(yàn)證BcERF070對(duì)于BcMLP328與BcbHLH30互作的影響，使用LCI實(shí)驗(yàn)證明浴麻，BcMLP328和BcbHLH30共轉(zhuǎn)染組中熒光明顯增強(qiáng)得问，然而在加入BcERF070之后，熒光強(qiáng)度顯著降低软免。EMSA實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)論宫纬。因此，BcERF070對(duì)BcMLP328與BcbHLH30的相互作用產(chǎn)生負(fù)向影響膏萧，這可能會(huì)降低BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對(duì)BcLFY的轉(zhuǎn)錄激活漓骚。
推測(cè)BcERF070是通過破壞BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物進(jìn)而延遲開花，那么BcMLP328沉默株系榛泛、BcERF070和BcMLP328雙沉默株系的開花時(shí)間理應(yīng)相似蝌蹂。但出乎意料的是，BcERF070和BcMLP328雙沉默株系的開花時(shí)間早于BcMLP328沉默株系挟鸠，蓮座葉也較少叉信。由此推測(cè)BcERF070也可能通過破壞BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物以外的途徑來影響開花。
6.BcERF070通過直接與BcBBX29啟動(dòng)子結(jié)合增強(qiáng)其表達(dá)
采用DAP-seq分析可視化觀察到在Bcc29的啟動(dòng)子區(qū)域存在較強(qiáng)的BcERF070結(jié)合峰硼身，以及在BcBBX29的啟動(dòng)子上可能存在結(jié)合區(qū)域。Y1H覆享、Dual-LUC報(bào)告實(shí)驗(yàn)佳遂、EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了BcERF070與BcBBX29啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá)。與對(duì)照株系相比撒顿，BcBBX29沉默株系的開花時(shí)間更早丑罪、蓮座葉更少、BcFT表達(dá)更強(qiáng)。在過表達(dá)BcBBX29的擬南芥中觀察到開花時(shí)間更晚吩屹、蓮座葉更多跪另。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BcERF070通過直接激活BcBBX29的轉(zhuǎn)錄來延緩開花煤搜。
在沒有乙烯的情況下嘲驾，BcERF070的表達(dá)量較低，導(dǎo)致開花提前迹卢。然而辽故，在乙烯存在的情況下，BcERF070的表達(dá)被誘導(dǎo)腐碱，增加的BcERF070通過直接互作破壞BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對(duì)BcLFY的激活誊垢，導(dǎo)致開花延遲；另外BcERF070還通過直接促進(jìn)開花抑制子BcBBX29的表達(dá)來抑制BcFT的表達(dá)喻杈，進(jìn)而誘導(dǎo)晚開花彤枢。
小結(jié)：該研究提出了BcERF070響應(yīng)乙烯調(diào)控小白菜開花的分子機(jī)制。外源乙烯處理增加了BcERF070的表達(dá)筒饰，延緩了開花缴啡。BcERF070通過削弱小白菜中BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對(duì)BcLFY的激活來延遲開花，此外BcERF070還直接促進(jìn)開花抑制子BcBBX29的表達(dá)瓷们，從而降低BcFT的表達(dá)业栅，進(jìn)而延緩開花。本研究為乙烯介導(dǎo)的小白菜晚開花提供了見解谬晕，并為應(yīng)用乙烯調(diào)控作物生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)碘裕。
文獻(xiàn)來源：Zhanghong Yu,Xiaoshan Chen, Yan Li, Sayyed Hamad Ahmad Shah, Dong Xiao, Jianjun Wang, XilinHou,? Tongkun Liu, Ying Li. ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing?BcLEAFY?expression,?Plant Physiology, 2024, kiae021,
