葡萄是一種營養(yǎng)豐富、美味可口的水果绣溜，深受世界各地消費者的喜愛。近年來娄蔼，無籽葡萄也越來越受大家的歡迎怖喻，因此，無籽葡萄品種的培育成為一個重要的育種目標(biāo)岁诉，而了解葡萄種子發(fā)育的分子遺傳調(diào)控機(jī)制對于無籽栽培品種的培育至關(guān)重要。
2023年4月13日涕癣，西北農(nóng)林科技大學(xué)王西平課題組的最新研究成果哗蜈，發(fā)表在Horticulture Research期刊上(影響因子7.291)，文章題目為“Control of ovule development in?Vitis vinifera?by?VvMADS28?and interacting genes”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了葡萄中一個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序及其靶基因距潘，揭示了VvMADS28參與葡萄胚珠和種子發(fā)育的調(diào)控機(jī)制炼列，為培育無籽葡萄新品種奠定了理論基礎(chǔ)。
MADS-box基因編碼高等植物中的一大類轉(zhuǎn)錄因子音比，并在植物發(fā)育過程中發(fā)揮各種作用俭尖，包括花、果實和種子發(fā)育洞翩。MADS結(jié)構(gòu)域蛋白通常以同型二聚體或異型二聚體的形式相互作用稽犁，從而擴(kuò)展了功能多樣性。在葡萄中菱农，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個參與種子形成的MADS-box基因（VviAGL11缭付、VvAG2、VvSEP3循未、VvMADS39、VvMADS45）秫舌。該課題組在之前發(fā)表的工作中揭示了VvMADS45在葡萄種子發(fā)育中的作用的妖，以及VvMADS39在花和胚珠發(fā)育中作用。本研究主要對MADS-box家族的VvMADS28進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗證及其分子調(diào)控機(jī)制的探究足陨。
本研究首先對葡萄中VvMADS28的時空表達(dá)模式進(jìn)行研究嫂粟。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，VvMADS28在有籽葡萄“紅地球”和無籽葡萄“湯普森無核”的多種組織中普遍都有表達(dá)墨缘。其中星虹，表達(dá)最強(qiáng)烈的組織是花序、花镊讼、果實宽涌，表達(dá)最弱的是根和葉。在胚珠發(fā)育過程中蝶棋，VvMADS28在“紅地球”30 DAF（開花后天數(shù)）表達(dá)最強(qiáng)烈卸亮，此后在“紅地球”中的表達(dá)一直強(qiáng)于“湯普森無核”，而且“紅地球”中VvMADS28基因的較強(qiáng)表達(dá)模式與種子發(fā)育相一致玩裙。此外兼贸，原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)，在2個品種的15 DAF胚珠中均能檢測到VvMADS28的mRNA表達(dá)吃溅∪艿“紅地球”中在30 DAF和35 DAF時均有相對較強(qiáng)的表達(dá)。相比之下决侈，“湯普森無籽”胚珠在25 DAF后幾乎沒有表達(dá)螺垢。該結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果相似。以上這些結(jié)果表明，VvMADS28在珠被的形成中起重要作用甩苛□彘梗基因功能不僅由基因的時空表達(dá)模式?jīng)Q定，還與該基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位有關(guān)讯蒲。在擬南芥原生質(zhì)體中表達(dá)攜帶GFP標(biāo)簽的VvMADS28痊土，檢測到熒光信號定位于細(xì)胞核，這表明VvMADS28是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子墨林。
通過ChIP-qPCR發(fā)現(xiàn)赁酝，在“湯普森無核”胚珠中VvMADS28的抑制與H3K27me3有關(guān)。在轉(zhuǎn)基因番茄中VvMADS28的過表達(dá)旭等，導(dǎo)致萼片增大酌呆、果實變小、種子數(shù)量減少搔耕，而種子大小沒有顯著的變化隙袁。與對照組相比，利用“紅地球”構(gòu)建的VvMADS28-RNAi株系表現(xiàn)為種子質(zhì)量減少弃榨、果實和種子體積縮小菩收、種子萎縮且排列不規(guī)格、種皮細(xì)胞排列松散鲸睛。這些結(jié)果說明VvMADS28在維持正常的種子發(fā)育中起重要作用娜饵。
采用酵母單雜交（Y1H）技術(shù)鑒定到VvMADS28上游的一個調(diào)控基因VvERF98，該基因編碼一個乙烯反應(yīng)因子官辈，它在2個葡萄品種中的表達(dá)模式與VvMADS28相似箱舞。此外，雙熒光素酶報告實驗拳亿、VvERF98-GUS?過表達(dá)實驗進(jìn)一步證明了VvERF98可以正調(diào)控VvMADS28的表達(dá)晴股。隨后，將種子用10 mM乙烯利處理风瘦，發(fā)現(xiàn)VvERF98和VvMADS28的表達(dá)水平均顯著升高队魏。這說明在種子發(fā)育過程中VvERF98是VvMADS28上游的一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，且可以響應(yīng)乙烯信號万搔。
采用DAP-seq技術(shù)鑒定了VvMADS28最顯著富集的結(jié)合基序為CArG?[序列是CC(A/T)6/8GG]胡桨，并篩選到4個與胚珠發(fā)育相關(guān)的潛在靶基因（WUSCHEL-related homeobox 1、HAIKU瞬雹、DA昧谊、?INNER NO OUTER）愿卸。Y1H實驗證實VvMADS28只與VvWUS?啟動子有相互作用国夜。另外，EMSA富蓄、雙熒光素酶報告實驗也證實了VvMADS28與VvWUS啟動子的互作。以上結(jié)果說明尚镰，VvMADS28通過結(jié)合VvWUS?啟動子中的CArG（ctattatatag）位點阀圾，抑制葡萄中VvWUS的表達(dá)。
采用酵母雙雜交（Y2H）技術(shù)狗唉，篩選了葡萄胚珠發(fā)育相關(guān)的VvMADS28的互作蛋白初烘，并鑒定到VvMADS5蛋白。利用Co-IP分俯、split-LUC互補(bǔ)分析肾筐，進(jìn)一步驗證了VvMADS28與VvMADS5之間的互作關(guān)系。
為進(jìn)一步闡明VvERF98缸剪、VvMADS5和VvWUS在種子發(fā)育中的相互作用吗铐，于是利用擬南芥分別構(gòu)建了每個基因相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系，以便開展功能分析杏节。在OE-VvMADS5株系中唬渗，葉片和角果增大、種子大小和重量增加拢锹，說明VvMADS5在胚珠和器官發(fā)育中起重要作用谣妻。同樣，在OE-VvERF98株系中卒稳，種子也增大，說明VvERF98?參與了胚珠的發(fā)育他巨。相反充坑，在OE-VvWUS株系中，葉片扭曲并產(chǎn)生簇狀分支染突、角果和種子縮小捻爷。VvWUS的mRNA在“湯普森無核”胚珠中高度積累，而VvMADS5和VvERF98的表達(dá)模式卻與之相反份企。
總結(jié)：在葡萄發(fā)育過程中也榄，VvERF98特異性地結(jié)合到VvMADS28啟動子上，正調(diào)控VvMADS28的表達(dá)司志。VvMADS28相對較低的表達(dá)水平與其啟動子區(qū)域H3K27me3抑制標(biāo)記的增加有關(guān)甜紫。VvMADS28特異性地與VvWUS啟動子區(qū)的CArG基序結(jié)合，抑制VvWUS的表達(dá)骂远，且VvMADS28（MADS-box II型MIKC分支）可與VvMADS5（MADS-box I型Mβ分支）互作協(xié)同調(diào)控這一過程囚霸。因此，VvMADS28-VvMADS5二聚體的維持以及VvWUS的表達(dá)穩(wěn)態(tài)激才，影響了葡萄花器官分化以及珠被細(xì)胞和胚乳細(xì)胞的發(fā)育拓型《詈伲總之，該研究揭示了VvMADS28在葡萄種子發(fā)育中的作用及分子機(jī)制劣挫，為無籽葡萄新品種的培育提供了寶貴的基因資源册养。
參考文獻(xiàn)：ZhangS, Wang L, Yao J, Wu N, Ahmad B, Nocker S, Wu J, Abudureheman R, Li Z,WangX.Control of ovule development in?Vitis viniferaby?VvMADS28and interacting genes.Horticulture Research.2023.?uhad070. doi.org/10.1093/hr/uhad070.
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