背景 巨噬細(xì)胞在肺腺癌（LUAD）的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）形成和腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。然而麦备，很少有研究全面系統(tǒng)地描述LUAD中巨噬細(xì)胞的特征孽椰。

方法 這項(xiàng)研究利用GSE189487數(shù)據(jù)集的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定了巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物。開(kāi)發(fā)了一種基于10種算法的集成機(jī)器學(xué)習(xí)程序凛篙，用于在癌癥基因組圖譜（TCGA）黍匾、GSE 30219、GSE31210和GSE72094數(shù)據(jù)集中構(gòu)建巨噬細(xì)胞相關(guān)指數(shù)（MRI）呛梆。使用幾種算法來(lái)評(píng)估MRI與TIME和免疫治療相關(guān)生物標(biāo)志物的相關(guān)性锐涯。使用GSE91061數(shù)據(jù)集評(píng)估MRI在預(yù)測(cè)免疫治療應(yīng)答中的作用。

結(jié)果 Lasso算法和plsRCox組合構(gòu)建的最佳MRI是LUAD的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素削彬，在預(yù)測(cè)LUAD患者的總生存率方面表現(xiàn)出穩(wěn)定和強(qiáng)大的性能全庸。MRI評(píng)分低的患者具有較高的TIME評(píng)分，較高的免疫細(xì)胞水平融痛，較高的免疫表型評(píng)分和較低的腫瘤免疫功能障礙和排斥（TIDE）評(píng)分壶笼，表明對(duì)免疫治療的反應(yīng)更好。MRI評(píng)分低的化療和靶向治療常用藥物的IC50值高于MRI評(píng)分高的藥物雁刷。此外覆劈，由MRI發(fā)展的生存預(yù)測(cè)諾模圖在預(yù)測(cè)LUAD的1年、3年和5年總生存率方面具有良好的臨床應(yīng)用潛力。

結(jié)論 作者的研究首次構(gòu)建了具有10種機(jī)器學(xué)習(xí)算法的LUAD共識(shí)MRI责语。MRI對(duì)LUAD的危險(xiǎn)分層炮障、預(yù)后判斷及治療方法的選擇有一定的參考價(jià)值。

機(jī)器學(xué)習(xí)目前在腫瘤和非腫瘤生信中越來(lái)越常見(jiàn)坤候，不管是構(gòu)建模型還是篩選關(guān)鍵基因胁赢，都有很出色的發(fā)揮。想做類似分析的朋友白筹，歡迎交流智末！

研究結(jié)果

單細(xì)胞分析揭示細(xì)胞亞型和巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物

采用嚴(yán)格的質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行預(yù)處理，作者從6種LUAD組織中獲得了17579份高質(zhì)量細(xì)胞樣本（圖2A）徒河。在標(biāo)準(zhǔn)化后系馆，在基因數(shù)目和測(cè)序深度之間獲得強(qiáng)正相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.94（圖2B）顽照。UMAP分析在所有細(xì)胞樣品中鑒定了11個(gè)簇（圖2C）由蘑。接下來(lái)，使用來(lái)自人原代細(xì)胞圖譜的參考數(shù)據(jù)代兵，將SingleR技術(shù)用于細(xì)胞類型注釋尼酿。結(jié)果，簇0植影、2谓媒、3、4何乎、7句惯、8和10被鑒定為巨噬細(xì)胞，簇1支救、5和9被鑒定為上皮細(xì)胞（圖2D）抢野。此外，組織干細(xì)胞支配簇6（圖2D）各墨≈腹拢基于“Seurat”軟件包的“FindAllMarkers”功能，在對(duì)應(yīng)于巨噬細(xì)胞的簇中顯著高表達(dá)的基因被鑒定為巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物贬堵。共有703個(gè)標(biāo)記基因?yàn)榫奘杉?xì)胞相關(guān)基因恃轩。

圖 2 LUAD中巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的鑒定

LUAD中與臨床結(jié)局相關(guān)的關(guān)鍵模塊識(shí)別

使用703個(gè)巨噬細(xì)胞相關(guān)基因構(gòu)建WGCNA，以確定與LUAD患者生存狀態(tài)和生存時(shí)間相關(guān)的關(guān)鍵模塊黎做。在將軟閾值β設(shè)置為0.85（無(wú)標(biāo)度R2 = 0.920）后叉跛，作者獲得了用于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的合適功效值（n = 4）（圖3 A）。最后蒸殿，總共生成了五個(gè)模塊以供進(jìn)一步分析筷厘，每個(gè)模塊之間的相關(guān)性如圖3 B所示鸣峭。這五個(gè)不同顏色模塊的聚類樹(shù)如圖3C所示∷盅蓿考慮到這五個(gè)模塊之間的相關(guān)系數(shù)摊溶，選擇與LUAD患者預(yù)后表現(xiàn)出最高正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的綠松石模塊（212個(gè)基因）和灰色模塊（46個(gè)基因）進(jìn)行進(jìn)一步研究（圖3D）。

圖 3 使用WGCNA在TCGA LUAD數(shù)據(jù)集中識(shí)別與臨床結(jié)局相關(guān)的關(guān)鍵模塊

基于NMF聚類的LUAD中兩種巨噬細(xì)胞相關(guān)亞型的識(shí)別

基于WGCNA選擇的258個(gè)巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物（綠松石模塊中的212個(gè)基因和灰色模塊中的46個(gè)基因）的表達(dá)模式充石，進(jìn)行NMF聚類算法以分類LUAD患者的分子亞型莫换。提出了最佳聚類數(shù)應(yīng)該是共表系數(shù)開(kāi)始急劇下降的K的第一個(gè)值。最后骤铃，在TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中浓镜，聚類數(shù)K為2被確定為最佳（圖4A）。圖4B顯示了TCGA數(shù)據(jù)集中相應(yīng)共識(shí)矩陣的熱圖劲厌。在TCGA組群中，組群1中的LUAD患者具有比組群2中的患者更好的總體存活率（圖4C听隐，P = 0.001）补鼻。在GSE 30219、GSE 31210和GSE 72094隊(duì)列中獲得了相似的結(jié)果雅任。相應(yīng)共識(shí)矩陣的熱圖如圖4 D风范、4 F和4 H所示。進(jìn)一步的存活分析顯示沪么，在GSE 30219（圖4 E硼婿，p < 0.001）、GSE 31210（圖4G禽车，p <0.001）和GSE 72094（圖4 I寇漫，p <0.001）組群中，在LUAD中殉摔，簇1與比簇2更好的臨床結(jié)果相關(guān)州胳。

圖 4 NMF算法在LUAD中識(shí)別出兩種巨噬細(xì)胞相關(guān)亞型

作者進(jìn)一步探討了LUAD中這兩個(gè)簇的分子特征。與簇 1 相比逸月，簇 2 中 M1 巨噬細(xì)胞的比例顯著更高（p = 0.005）栓撞，如圖 5A 所示。簇1和簇2之間的M1和M2巨噬細(xì)胞表型評(píng)分沒(méi)有顯著差異（圖5 B碗硬，p > 0.05）瓤湘。這些結(jié)果可能表明，這兩個(gè)集群的關(guān)系與M1和M2巨噬細(xì)胞的極化無(wú)關(guān)恩尾。為了進(jìn)一步探索它們的相關(guān)性弛说，作者進(jìn)行了GSEA。如圖5C所示翰意，簇 1 主要參與免疫相關(guān)通路剃浇，包括用于產(chǎn)生 IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)巾兆、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路和細(xì)胞粘附分子（CAM），如圖 5C 所示虎囚。簇2主要與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的途徑相關(guān)角塑，包括細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和P53信號(hào)傳導(dǎo)途徑（圖5D）淘讥。此外圃伶，第1組中LUAD患者的炎癥反應(yīng)評(píng)分顯著高于第2組中的炎癥反應(yīng)評(píng)分（圖5 E，p = 0.021）蒲列。有趣的是窒朋，簇2中的LUAD患者具有與增殖、糖酵解和缺氧相關(guān)的較高基因集評(píng)分（圖5 F-H蝗岖，所有p < 0.001）侥猩。這些結(jié)果表明，在LUAD中抵赢，簇1表型可能是一個(gè)相對(duì)的“免疫炎癥”表型欺劳，而簇2可能是一個(gè)相對(duì)的“致癌”表型。

圖 5 兩個(gè)團(tuán)簇的分子特征及其相關(guān)性

共識(shí)MRI的一體化構(gòu)建

通過(guò)單因素Cox分析铅鲤，作者確定了62個(gè)與LUAD預(yù)后顯著相關(guān)的潛在巨噬細(xì)胞相關(guān)基因划提。這62個(gè)潛在的與巨噬細(xì)胞相關(guān)的預(yù)后基因經(jīng)歷了整合的基于機(jī)器學(xué)習(xí)的過(guò)程，從中作者開(kāi)發(fā)了一個(gè)一致的MRI邢享。在TCGA-LUAD隊(duì)列中鹏往，作者通過(guò)leave-one-out交叉驗(yàn)證框架擬合了101種預(yù)測(cè)模型。在所有隊(duì)列中計(jì)算每個(gè)模型的C指數(shù)骇塘，結(jié)果如圖6A所示伊履。因此，通過(guò)Lasso和plsRCox方法的組合開(kāi)發(fā)的預(yù)后模型被證明是具有最高平均C指數(shù)0.65的最佳模型（圖6A）款违。偏差的部分概率在Lasso回歸中達(dá)到最小值（圖6B）湾碎。接下來(lái)，對(duì)具有非零Lasso系數(shù)的22個(gè)巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行plsRCox回歸奠货。因此介褥，用最終一組22個(gè)巨噬細(xì)胞相關(guān)基因構(gòu)建共有MRI，包括SCGB 3A 1递惋、IRX 2柔滔、HPCAL 1、HMGN 3萍虽、MS 4A 15睛廊、MBIP、LPCAT 1杉编、TM 4SF 1超全、GPX 3咆霜、S100 A10、HOPX嘶朱、PPIA蛾坯、NECAB 3、RRAS疏遏、UBA 1脉课、PLBD 1、BLVRB财异、DNAJA 1倘零、PRDX 6、UQCRB戳寸、UBAC 2和STK 24（圖6C）呈驶。這22個(gè)巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的回歸系數(shù)如圖6C所示。此外疫鹊，根據(jù)這22個(gè)巨噬細(xì)胞相關(guān)基因及其表達(dá)模式的回歸系數(shù)計(jì)算每個(gè)LUAD患者的MRI評(píng)分袖瞻。此外，使用MRI評(píng)分的平均值作為分界點(diǎn)订晌，將LUAD患者分為高M(jìn)RI評(píng)分組和低MRI評(píng)分組。如預(yù)期的蚌吸，具有高M(jìn)RI評(píng)分的LUAD患者與TCGA組群（圖6 D锈拨，p < 0.001）、GSE 30219（圖6 E羹唠，p = 0.005）奕枢、GSE 31210（圖6 F，p = 0.003）和GSE 72094（圖6 G佩微，p < 0.001）組群中的不良總體存活率相關(guān)缝彬。

圖 6 綜合機(jī)器學(xué)習(xí)確定了共識(shí)巨噬細(xì)胞相關(guān)指數(shù)（MRI）

MRI性能評(píng)價(jià)

TimeROC分析評(píng)價(jià)了MRI對(duì)LUAD患者總生存率的區(qū)分，TCGA隊(duì)列中1哺眯、3和5年AUC分別為0.702谷浅、0.678和0.664。此外奶卓，GSE 30219隊(duì)列的1年一疯、3年和5年AUC分別為0.798、0.697和0.680夺姑。在GSE 31210和GSE 72094隊(duì)列中墩邀，1年、3年和5年AUC分別為0.653盏浙、0.610和0.670以及0.648眉睹、0.597和0.690荔茬。臨床ROC曲線顯示，在TCGA竹海、GSE 30219慕蔚、GSE 31210和GSE 72094隊(duì)列中，MRI的AUC高于年齡站削、性別和臨床分期的AUC坊萝。此外，在TCGA许起、GSE 30219十偶、GSE 31210和GSE 72094隊(duì)列中，MRI的C指數(shù)高于其他臨床病理學(xué)參數(shù)园细，包括年齡惦积、性別和臨床分期。因此猛频，與其他臨床病理參數(shù)相比狮崩，本研究的MRI可能在預(yù)測(cè)LUAD的總生存率方面具有更好的性能。為了進(jìn)一步評(píng)估MRI在預(yù)測(cè)鹿寻、GSE 31210和GSE 72094隊(duì)列中的性能睦柴。此外，在TCGA毡熏、GSE 30219坦敌、GSE 31210和GSE 72094隊(duì)列中，MRI的C指數(shù)高于其他臨床病理學(xué)參數(shù)痢法，包括年齡狱窘、性別和臨床分期。因此财搁，與其他臨床病理參數(shù)相比蘸炸，本研究的MRI在預(yù)測(cè)LUAD的總生存率方面具有更好的性能。為了進(jìn)一步評(píng)估MRI在預(yù)測(cè)LUAD總生存率方面的性能尖奔，將MRI的C指數(shù)與LUAD中建立的70個(gè)其他預(yù)后特征（mRNA和lncRNA相關(guān)特征）進(jìn)行了比較搭儒。結(jié)果，MRI的C指數(shù)高于除Gong-XX標(biāo)記之外的69個(gè)預(yù)后標(biāo)記的C指數(shù)（圖7A）提茁，表明本研究的MRI在預(yù)測(cè)LUAD的臨床結(jié)果方面顯示出比許多模型更好的性能仗嗦。此外，單變量和多變量Cox回歸分析表明甘凭，MRI是TCGA稀拐、GSE 30219、GSE 31210和GSE 72094隊(duì)列中LUAD總生存率的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（圖7 B和C丹弱，所有p < 0.05）德撬。在LUAD的高和低MRI評(píng)分組之間铲咨，在臨床分期、pT分期和pN分期中獲得了顯著差異（所有p < 0.05）蜓洪。具體而言纤勒，高M(jìn)RI評(píng)分表明LUAD的臨床分期較高（p < 0.001）、pT分期較高（p < 0.05）和pN分期較高（p < 0.01）隆檀。

圖 7 評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞相關(guān)指數(shù)（MRI）的性能

基于MRI的腫瘤微環(huán)境解剖

先前的研究表明摇天，腫瘤免疫景觀可分為六種亞型，包括傷口愈合（C1）恐仑、IFN-γ顯性（C2）泉坐、炎性（C3）、淋巴細(xì)胞耗竭（C4）裳仆、免疫靜止（C5）和TGF- β顯性（C6）腕让。本研究顯示，低MRI評(píng)分組中炎性亞型的比例最大歧斟，高M(jìn)RI評(píng)分的LUAD患者中比例最高的是IFN-g顯性亞型（圖8A纯丸，p = 0.001）。進(jìn)一步研究表明静袖，MRI評(píng)分低的LAUD患者的免疫評(píng)分觉鼻、基質(zhì)評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分較高（圖8B，所有p < 0.05）队橙。接下來(lái)坠陈，作者使用幾種免疫細(xì)胞相關(guān)算法探索了MRI評(píng)分和免疫細(xì)胞豐度之間的相關(guān)性，這揭示了MRI評(píng)分與大多數(shù)免疫細(xì)胞的豐度顯著負(fù)相關(guān)（圖8C喘帚，所有p < 0.05）畅姊。此外咒钟，低MRI評(píng)分組中的B細(xì)胞吹由、iDCs肥大細(xì)胞、T輔助細(xì)胞和TIL的評(píng)分高于高M(jìn)RI評(píng)分組（圖8D朱嘴，所有p < 0.05）倾鲫。與APC共抑制、MHC-I類萍嬉、炎癥前和I型IFN反應(yīng)相關(guān)的基因集評(píng)分較低乌昔，而與T細(xì)胞共刺激和II型IFN反應(yīng)相關(guān)的基因集評(píng)分較高，較高的基因集評(píng)分與T細(xì)胞共刺激和II型-IFN-應(yīng)答相關(guān)（圖8E壤追，所有p < 0.05）磕道。在本研究中，作者具有高M(jìn)RI評(píng)分的LUAD患者具有更高水平的一些免疫檢查點(diǎn)行冰，如PD 1溺蕉、HAVCR 2伶丐、CD 70、CD 276和TNFSF 4（圖8F疯特，所有p < 0.05）哗魂。在具有高M(jìn)RI評(píng)分的LUAD患者中，一些HLA相關(guān)基因的水平顯著更高漓雅，包括HLA-A录别、HLA-B和HLA-G（圖8G，所有p < 0.05）邻吞。證據(jù)表明组题，低MRI評(píng)分可能是LUAD中相對(duì)“熱”的腫瘤表型，而高M(jìn)RI評(píng)分可能是相對(duì)“冷”的腫瘤表型吃衅。

圖 8 基于巨噬細(xì)胞相關(guān)指數(shù)（MRI）的腫瘤微環(huán)境解剖

基于MRI的LUAD治療策略

上述結(jié)果揭示了低和高M(jìn)RI評(píng)分組之間腫瘤微環(huán)境的顯著差異往踢。低MRI評(píng)分可能是LUAD中的“熱”腫瘤表型。因此徘层，這兩組在免疫治療反應(yīng)方面可能存在顯著差異峻呕。在本究中，作者觀察到具有高M(jìn)RI評(píng)分的LUAD患者具有較高的免疫監(jiān)視評(píng)分（圖9 A趣效，p = 0.008）瘦癌、較高的免疫逃逸評(píng)分（圖9 B，p = 0.013）跷敬、較高的TIDE評(píng)分（圖9 C讯私，p = 0.001）和較低的CTLA 4免疫表型評(píng)分（圖9 D，p = 0.006）西傀。TIDE和免疫表型評(píng)分被認(rèn)為是預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)的可靠工具斤寇。低TIDE評(píng)分和高免疫表型評(píng)分表明更好的免疫治療益處。因此拥褂，MRI評(píng)分低的LUAD患者可能對(duì)免疫治療更敏感娘锁。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果，作者使用GSE 91061隊(duì)列（免疫治療隊(duì)列）檢查了預(yù)后饺鹃，免疫治療益處和MRI評(píng)分之間的關(guān)系莫秆。如所預(yù)期的，無(wú)應(yīng)答者（PD/SD）的MRI評(píng)分顯著高于應(yīng)答者（PR/CR）（圖9 E悔详，p < 0.05）镊屎。與高M(jìn)RI評(píng)分組相比，低MRI評(píng)分組的應(yīng)答率顯著更高（圖9 E茄螃，p < 0.05）缝驳。此外，Kaplan-Meier生存曲線表明低MRI評(píng)分組的總生存率高于高M(jìn)RI評(píng)分組（圖9 E，p = 0.018）用狱。這些結(jié)果進(jìn)一步表明萎庭，低MRI評(píng)分的LUAD患者可能對(duì)免疫治療更敏感。接下來(lái)齿拂，作者探索了常見(jiàn)化療和靶向治療藥物的IC50值驳规。因此，在MRI評(píng)分較高的LUAD患者中署海，克唑替尼吗购、Savolitinib、Ulixertinib砸狞、5-氟尿嘧啶捻勉、順鉑、多西他賽刀森、吉西他濱和紫杉醇的IC50值較低（圖9 F踱启，所有p < 0.05），表明MRI評(píng)分較高的LUAD可能對(duì)化療和靶向治療更敏感研底。一些藥物的3D結(jié)構(gòu)如圖9 G所示埠偿。

圖 9 基于巨噬細(xì)胞相關(guān)指數(shù)（MRI）的LUAD治療策略

結(jié)論

該研究通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定了巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物，并使用10種機(jī)器學(xué)習(xí)算法組合構(gòu)建了MRI榜晦。主要發(fā)現(xiàn)包括 MRI 是 LUAD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素冠蒋，在預(yù)測(cè)總生存期方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的表現(xiàn)，并表明 MRI 評(píng)分低的患者對(duì)免疫治療的反應(yīng)更好乾胶。該研究得出的結(jié)論是抖剿，MRI 可以幫助 LUAD 患者的風(fēng)險(xiǎn)分層、預(yù)后和治療選擇识窿。巨噬細(xì)胞在LUAD的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）形成和癌癥進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用斩郎。該研究使用 10 種機(jī)器學(xué)習(xí)算法開(kāi)發(fā)了巨噬細(xì)胞相關(guān)指數(shù) （MRI） 來(lái)預(yù)測(cè) LUAD 的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)。最佳MRI被確定為L(zhǎng)UAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素喻频，在預(yù)測(cè)總生存期方面表現(xiàn)出很強(qiáng)的表現(xiàn)缩宜。MRI評(píng)分低的患者對(duì)免疫治療有更好的反應(yīng)，免疫細(xì)胞水平更高半抱。MRI 可能有助于LUAD 的風(fēng)險(xiǎn)分層脓恕、預(yù)后和治療選擇膜宋。